Reproduzierbare Einrichtung für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Kontraktilität der zervikalen Lymphgefäße und des Lymphflusses bei Mäusen

Wir stellen die Notwendigkeit einer neuen Bildgebung der Kontraktilität zervikaler lymphatischer Gefäße und der lymphatischen Entfernung roter Blutkörperchen bei Mäusen dar. Die Untersuchung der Funktionen zervikaler Lymphgefäße ist eine Herausforderung, insbesondere wenn eine langfristige Beobachtung der Kontraktilität des Lymphflusses und der Tracerzirkulationen erforderlich ist. Zu Beginn setzen Sie eine Stahloptikschiene von 270 Millimetern Länge und 43 Millimeter Breite als Basis des Geräts.

Installieren Sie zwei Pfostenhalter auf der Stahl-Optikschiene und gewährleisten Sie einen Abstand von 175 Millimetern zwischen ihnen. Setzen Sie zwei Befestigungspfosten mit einem Durchmesser von 12 Millimetern in die Pfostenhalter ein und sichern Sie jeden mit einer M6-Schraube. Dann befestigen Sie an jedem der beiden Befestigungspfosten einen Pfostenkragen.

Befestigen Sie eine rechtwinklige, feste Pfostenklemme an einem der Befestigungspfosten und befestigen Sie ihn fest mit einer M6-Schraube. Setzen Sie einen 12-Millimeter-Montagepfosten in das Seitenloch der rechtwinkligen Pfostenklemme. Befestigen Sie einen 3D-gedruckten Halter am eingesetzten Seitenbefestigungspfosten und befestigen Sie ihn sicher mit zwei Paar M3-Schrauben.

Mit UV-aushärtendem Kleber wird ein 12-millimeter-Durchmesser Abdeckungsglas an der Unterseite eines schützenden 3D-gedruckten Gehäuses befestigt. Dann befestigt man das Schutzgehäuse mit einem M4-Schrauben-/Mutter-Paar am 3D-gedruckten Halter. Installieren Sie einen Präzisionsstromabnehmertisch für vertikale Bewegung auf der Stahl-Optikschienenbasis mit zwei Tischklammern und Sätzen von M6-Schrauben, Muttern und Unterlegscheiben.

Dann legen Sie eine 3D-gedruckte Hülle mit 155 Millimetern Länge und 110 Millimeter Breite auf die Tischplatte. Dieses Gehäuse dient als Reservoir zur Ansammlung von salzhaltiger Lösung. Decken Sie die Verbindungsstelle der Drähte zum Heizelement Eins mit einer dünnen Silikonschicht ab.

Befestige einen Temperatursensor an der Matte und versiegele ihn mit Silikon. Löten Sie die Drähte des Heizelements und die Temperatursensoren an ein Mehrdrahtkabel. Füllen Sie die Befestigungsstelle mit Silikon und schließen Sie sie mit Schrumpffolie.

Setze Heizelement zwei und Temperatursensor zwei in die Schaumstoffrolle. Befestige die Stecker für das Stromkabel und den Netzschalter an den Wänden des Gehäuses der Steuergeräte. Installieren Sie ein 24-Volt-Gleichstromnetzteil, einen Gleichstrom-Step-down-Wandler und zwei MOSFET-Module im Gehäuse.

Nach dem Zusammenbau der Schaltung und dem Löten der erforderlichen Komponenten befestigen Sie das Arduino Uno und den Tastaturbildschirm im Deckelgehäuse. Finden Sie das Temperaturauswahlfeld. Stelle die Temperatur ein und drücke auf Run.

Nach der Betäubung der Maus tragen Sie beide Augenlider mit Augensalbe auf, um das Austrocknen der Augäpfel während der Operation zu verhindern. Sobald der Rückzugsreflex und das Tail-Tucking-Reflex aufhören, legen Sie die Maus auf den Rücken auf das Heizelement, um Zugang zum Bauchbereich zu ermöglichen. Stecken Sie die Steuereinheit an eine Steckdose mit einer Eingangsspannung von 175 bis 240 Volt Wechselstrom.

Mit medizinischem Klebeband fixieren Sie den Körper des Tieres parallel zur Tischoberfläche und legen Sie den Kopf schräg zur sagittalen Achse, sodass eine Seite des Halses auf der Rolle ruht. Wickeln Sie eine Ligatur um die oberen Schneidezähne und befestigen Sie sie an der Rückseite des Geräts und verwenden Sie medizinisches Klebeband, um die Körpertemperatur des Tieres zu halten. Als Nächstes rasieren Sie das Fell am Halsbereich.

Dann entfernen Sie alle verbleibenden losen Haare und decken Sie das Tier ab, um das sterile Feld zu erhalten. Für die Primärdesinfektion desinfizieren Sie die Haut am Hals mit einem Alkoholabstrich. Anschließend tragen Sie eine 0,5%ige Chlorhexidinlösung oder eine 2%ige Jodlösung zur antiseptischen Behandlung auf und wiederholen den Desinfektionsprozess noch zweimal.

Nach Bestätigung der Anästhesietiefe durch den Zehenkneifreflex wird eine Dermatotomie durchgeführt, indem ein Längsschnitt entlang der Halshaut vom Unterkiefer bis zum Schlüsselbein gemacht wird, etwa zwei Zentimeter lang. Anschließend führen Sie eine Fasziotomie mit einer mikrochirurgischen gebogenen Schere durch. Mit einer gebogenen Pinzette werden die Speicheldrüsen und oberflächlichen Nackenmuskeln vorsichtig beiseitegeschoben, um den Musculus sternocleidomastoideus freizulegen.

Stellen Sie sicher, dass sichtbare Blutgefäße nicht beschädigt werden, und befeuchten Sie das Operationsfeld kontinuierlich mit Kochsalzlösung, um Gewebeschäden zu verhindern. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Schere, um eine Myotomie des Musculus sternocleidomastoideus durchzuführen und so Zugang zum Bereich zwischen Luftröhre und Halsschlagader zu erhalten. Setzen Sie die Spannung der Muskeln und der Faszie fort und führen Sie sowohl Myotomie als auch Fasziotomie durch.

Anschließend lokalisieren Sie den tiefen zervikalen Lymphknoten sowie die afferenten und efferenten Lymphgefäße in einer Tiefe von fünf bis sieben Millimetern. Stellen Sie das Gerät mit dem festen Tier auf den beweglichen Mikroskoptisch. Und sichern Sie das Gerät, indem Sie es mit einer M6-Schraube fest befestigen, um während der Bildgebung Stabilität zu gewährleisten.

Befestigen Sie den Katheter, vorgefüllt mit Kochsalzlösung, mit medizinischem Klebeband am Befestigungsposten. Platzieren Sie eine Walze mit einem Durchmesser von einem Zentimeter unter das Heizelement an der Seite des Tierkopfes, um eine 45-Grad-Neigung relativ zum Mikroskoptisch zu halten. Dann positionieren Sie den festen Katheter in den chirurgisch geöffneten Halsbereich, sodass er in der Nähe des Schlüsselbeins des Tieres liegt, und schalten Sie die Kochsalzzufuhr ein, um die offene Halshöhle mit Kochsalzlösung zu füllen.

Senken Sie die Schutzhülle über den mit Kochsalzlösung gefüllten Halsbereich, sodass das Lymphgefäß im Zentrum des Sichtfeldes liegt. Dann legen Sie die Schutzhülle ohne Druck auf die Luftröhre an. Schließlich senken Sie die nicht-wasserimmersionsbasierte Zweiphotonenlinse in das Schutzgehäuse auf die korrekte Tiefe basierend auf dem Arbeitsabstand der Linse und führen Sie eine Zwei-Photonen-Visualisierung des zervikalen lymphatischen Gefäßes durch.

Nach dem Eingriff wurde die erfolgreiche Identifizierung der tiefen zervikalen Lymphknoten durch eine Evans-Blue-Ansammlung im Gewebe bestätigt. Vor und nach der Photobiomodulation wurde eine Zwei-Photonen-Überwachung der Kontraktilität der zervikalen lymphatischen Gefäße durchgeführt. Die Photobiomodulation erhöhte signifikant die Kontraktilität der zervikalen lymphatischen Gefäße bei 2- und 18 Monate alten Mäusen mit ähnlicher Intensität.

Quantitative Analysen zeigten, dass die Kontraktilität der zervikalen lymphatischen Gefäße bei 24 Monate alten Mäusen signifikant niedriger war als bei 2- und 18 Monaten. Die Werte unterschieden sich jedoch nicht signifikant zwischen 2 und 18 Monaten alten Mäusen. Die Photobiomodulation erhöhte signifikant die Kontraktilität der zervikalen lymphatischen Gefäße bei 2- und 18 Monaten, hatte jedoch keine Wirkung bei 24 Monaten alten Mäusen.

Rote Blutkörperchen, die in den rechten Seitenventrikel injiziert wurden, wurden vier Stunden nach der Injektion in den Halslymphgefäßen beobachtet und bewegten sich nach fünf Stunden weiter durch das Lumen, was den Richtungsfluss vom Gehirn zur Peripherie bestätigte. Unser Protokoll ermöglicht die in vivo Überwachung der Funktion zervikaler lymphatischer Gefäße bei Aufrechterhaltung der Kontraktilität für bis zu fünf Stunden Beobachtung. Unsere Methode bietet eine gute Reproduzierbarkeit und ist mit verschiedenen Zweiphotonenmikroskopen und Objektivlinsen kompatibel, während gleichzeitig hochwertige Bilder mit Tiefen von bis zu 500 Mikrometern erhalten bleiben.

Diese Technik kann potenziell zu einem universellen Werkzeug zur Untersuchung der Physiologie des Hirndrainagesystems und der Funktionen zervikaler lymphatischer Gefäße werden.