Multimodaler Ansatz zur Bewertung der Knochenregeneration und der Gerüstleistung

Unsere Forschung bewertet, wie verschiedene Biomaterialien während des Regenerationsprozesses die Knochenarchitektur beeinflussen. Die Knochenregeneration erfordert eine multiskalige Bewertung, da sie ein hierarchisch organisiertes Gewebe ist. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der Probe auf verschiedenen Skalen.

Zu Beginn befestigen Sie das harzhaltige Schienbein, das das implantierte Biomaterial enthält, am Probenhalter und befestigen Sie es am Instrumentenarm. Orientieren Sie die Probe entsprechend der gewünschten Schnittrichtung. Besorgen Sie eine Diamantsägescheibe mit niedriger Geschwindigkeit, um den Knochen in etwa 0,7-Millimeter-Schnitte zu schneiden.

Füllen Sie das Flüssigkeitsreservoir, bis der Flüssigkeitsstand die untere Kante der Klinge vollständig bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Probe stabil und horizontal mit der Scheibenoberfläche ausgerichtet ist. Stellen Sie die Probeposition mit den Positionierknöpfen ein, bis der Zielschnittbereich mit der Klinge übereinstimmt.

Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe mit höherer Geschwindigkeit und üben Sie niedrigen Druck aus, bis sich eine Vertiefung bildet. Dann wird die Geschwindigkeit reduziert, um das Schneiden reibungslos abzuschließen und Vibrationen zu minimieren. Stoppen Sie die Säge sofort nach Abschluss des Schnitts.

Anschließend wird die Schnittprobe mit einem Stereomikroskop zur Montage untersucht. Für die Montage wird eine selbstgebaute Baugruppe verwendet, bestehend aus einem inneren massiven Edelstahlzylinder und einem äußeren Hohlzylinder, der beim Polieren mechanische Unterstützung bietet. Als Nächstes stellen Sie den inneren Zylinder auf eine Heizplatte und erhitzen Sie ihn auf etwa 120 bis 140 Grad Celsius.

Wählen Sie ein geeignetes Wachs aus, tragen Sie eine kleine Menge Wachs auf die Oberfläche des erhitzten Zylinders auf und lassen Sie ihn vollständig schmelzen. Dann legen Sie die Probe mit der interessanten Oberfläche nach unten auf die wachsbeschichtete Fläche und drücken Sie die Probe vorsichtig, um einen vollständigen Kontakt mit dem geschmolzenen Wachs sicherzustellen. Dann entferne den Aluminiumzylinder von der Heizplatte und lass das Wachs bei Raumtemperatur erstarren.

Für grobe und mittlere Polierung wählen Sie Schleifpapier mit den Körnungsgrößen 1, 200, 2, 500 und 4, 100, um die Probendicke auf etwa 0,15 Millimeter zu reduzieren. Beginnen Sie mit 1 Schleifpapier mit 200 Körnung, gefolgt von 2 Schleifpapier mit 500 Körnung und leichtem Druck. Überwachen Sie regelmäßig die Probendicke während des Polierens mittels Reflexionsmikroskopie.

Sobald die Zieldicke erreicht ist, polieren Sie beide Seiten der Probe mit 4.100-Schleifpapier. Reinigen Sie die Probe bei jedem Polierschritt kontinuierlich mit destilliertem Wasser. Für das Endpolieren wählen Sie eine Diamantpaste mit einer Partikelgröße von sechs oder drei Mikrometern, abhängig von der Oberflächenrauheit der Probe.

Tragen Sie eine kleine Menge Diamantpaste auf ein Filzpoliertuch auf, das auf einer Polierplatte montiert ist, und polieren Sie die Probe. Um die Probe vom Zylinder zu lösen, erhitze das Wachs auf einer heißen Platte. Nachdem Sie das Gerät von der Heizplatte entfernt haben, nehmen Sie die Probe aus dem Zylinder.

Anschließend polieren Sie beide Seiten der Probe vorsichtig mit minimalem Druck und trocknen Sie die polierte Oberfläche mit Filterpapier. Vor der mikroskopischen Analyse wird die Probe zwischen einem Glasträger und einem Deckmantel montiert, wobei Immersionsöl als Montagemedium dient. Untersuchen Sie die Orientierung der Kollagenfaser mittels einer Polarisationslichtmikroskopie, beginnend mit einer niedrigen Vergrößerung zwischen 5x und 10x.

Schließlich wird die Probe für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet, um die Knochen-Biomaterial-Grenzfläche weiter zu analysieren. Nach dem Polieren und der ersten optischen Mikroskopieuntersuchung ermöglichten intrinsische Probenmerkmale, den unter der Lichtmikroskopie identifizierten Bereich mit dem entsprechenden Ort im mikrocomputergestützten Tomographie-Datensatz abzugleichen. Die polarisierte Lichtmikroskopie unterschied bereits vorhandenen Knochen, der in Blau dargestellt wurde, von neu gebildetem Knochen während der Heilung, der in Orange dargestellt ist.

Die polarisierte Lichtmikroskopie mit höherer Vergrößerung zeigte eine Grenzfläche, an der Knochen im engen Gegensatz zum bereits vorhandenen kortikalen Knochen mit Typ-I-Kollagenfasern wuchsen, die senkrecht in einem dünnen Bereich ausgerichtet waren. Die Bildgebung der Rasterelektronenmikroskopie ermöglichte eine präzise Lokalisierung von Interessengebieten. Ein Band der ausgewählten Region wurde weiter mittels Slice-and-View-Tomographie untersucht.

Die Front des Grabens zeigte Knochenmorphologie auf einer wachsenden Trabecula. Die Transmissionselektronenmikroskopie ermöglicht eine nanoskalige Untersuchung der Knochen-Biomaterial-Grenzfläche, die mit ausgewählter Flächen-Elektronenbeugung kombiniert werden kann. Ausgewählte Flächen-Elektronenbeugungsmuster zeigten, dass sowohl der Biomaterialbereich als auch der Knochenbereich aus Hydroxyapatitkristallen bestanden.

Energiedispersive Röntgenspektroskopiekartierung der abgebildeten Grenzregion zeigte Phosphor und Kalzium. Dieser multimodale Workflow liefert ergänzende Erkenntnisse, die mit einer einzigen Bildgebungstechnik nicht erreicht werden können. Dieser Arbeitsablauf erfordert erhebliche Zeit, technisches Fachwissen und Zugang zu spezialisierter Instrumentierung.

Es kann funktionelle Korrelationen, langfristige Knochenremodellierung und Biomaterialdesign untersuchen.