Name: In vitro Reassoziationstest zur Messung der Bildung von ribosomalen Partikeln aus den 80er Jahren mit salzgewaschenen Ribosom-Subeinheiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Lernen Sie die in vitro-Reassoziation von Ribosomen-Untereinheiten zur Analyse von 80S-Partikelbildung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Untereinheiten-Interaktionen bei der Proteinbiosynthese.

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<ol><li>Hinnebusch, A. G., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation%3A+new+insights+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation: new insights and challenges.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (10), a01154(2012).</li>
<li>Fringer, J. M., Acker, M. G., Fekete, C. A., Lorsch, J. R., Dever, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+release+of+eukaryotic+translation+initiation+factors+5B+and+1A+from+80S+ribosomes+following+subunit+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupled release of eukaryotic translation initiation factors 5B and 1A from 80S ribosomes following subunit joining.</a> Mol Cell Biol. 27 (6), 2384-2397 (2007).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Kisly, I., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaea%2Feukaryote-specific+ribosomal+proteins%3A+guardians+of+a+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Archaea/eukaryote-specific ribosomal proteins: guardians of a complex structure.</a> Comput Struct Biotechnol J. 21 (1), 1249-1261 (2023).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Gossen, M., Dittmar, G., Selbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+cellular+protein+translation+by+pulsed+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC.</a> Proteomics. 9 (1), 205-209 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Kisly, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+eL19+and+eB12+intersubunit+bridge+in+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional role of eL19 and eB12 intersubunit bridge in the eukaryotic ribosome.</a> J Mol Biol. 428 (10 Pt B), 2203-2216 (2016).</li>
<li>Kisly, I., Remme, J., Tamm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+protein+eL24%2C+involved+in+two+intersubunit+bridges%2C+stimulates+translation+initiation+and+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribosomal protein eL24, involved in two intersubunit bridges, stimulates translation initiation and elongation.</a> Nucleic Acids Res. 47 (1), 406-420 (2019).</li>
<li>Tamm, T., Kisly, I., Remme, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+ribosomal+intersubunit+bridges+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of ribosomal intersubunit bridges in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 213 (4), 1329-1339 (2019).</li>
<li>Konikkat, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+60S+ribosomal+subunit+assembly+emerging+from+recent+studies+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Principles of 60S ribosomal subunit assembly emerging from recent studies in yeast.</a> Biochem J. 474 (2), 195-214 (2017).</li>
<li>Steffen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+deficiency+protects+against+ER+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome deficiency protects against ER stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 191 (1), 107-118 (2012).</li>
<li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Getting started with yeast.</a> Methods Enzymol. 350 (1), 3-41 (2002).</li>
<li>Liiv, A., O'Connor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+intersubunit+bridge+regions+of+23S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutations in the intersubunit bridge regions of 23S rRNA.</a> J Biol Chem. 281 (40), 29850-29862 (2006).</li>
<li>Kipper, K., Hetényi, C., Sild, S., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+intersubunit+bridge+B2a+is+involved+in+factor-dependent+translation+initiation+and+translational+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal intersubunit bridge B2a is involved in factor-dependent translation initiation and translational processivity.</a> J Mol Biol. 385 (2), 405-422 (2009).</li>
<li>Lilleorg, S., Reier, K., Remme, J., Liiv, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersubunit+bridge+B1b+of+the+bacterial+ribosome+facilitates+initiation+of+protein+synthesis+and+maintenance+of+translational+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The intersubunit bridge B1b of the bacterial ribosome facilitates initiation of protein synthesis and maintenance of translational fidelity.</a> J Mol Biol. 429 (7), 1067-1080 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonsäure (HEPES)</td><td>Fisher-Bioreagenzien</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>70-mL-Zentrifugen-Flaschendeckel</td><td>Beckman Coulter</td><td>355623</td><td></td></tr><tr><td>Akta UVIS-920-Monitor</td><td>GE Health</td><td>70407</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&nbsp; Ultra-Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Millipore</td><td>UFC9100</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Hefeextrakt</td><td>Gibco</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Blaue abgestufte Pipettenspitzen, 1000 & Mikro; L</td><td>TipOne</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Flaschendeckel-Filtrationseinheit, Trichter nur 500 mL</td><td>Starlab</td><td>CC8222-5226</td><td></td></tr><tr><td>C-MAG HS 7 magnetische Rührplatte</td><td>IKA</td><td>S000</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugen-Biofuge-Fresko</td><td>Heraeus-Instrumente</td><td>75005510/01</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen 600 mL</td><td>Hettich</td><td>0551</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotina 420R&nbsp;</td><td>Hettich</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge-Drehrotor&nbsp;</td><td>Hettich</td><td>4784-A+4780+4783</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukosemonohydrat</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>A11090.36</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Cuvetten 1,5 ml</td><td>Plastibrand</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher-Bioreagenzien</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenrohre</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor 45 Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen (&Oslash; 0,25–0,5 mm)</td><td>Carl Roth</td><td>A553.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Maker 100 mL Gesamtvolumen</td><td>Hoefer Wissenschaftliche Instrumente</td><td>SG100</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Maker 30 mL Gesamtvolumen & nbsp;</td><td>Hoefer Wissenschaftliche Instrumente</td><td>SG30</td><td></td></tr><tr><td>Heiz-/Kühl-Trockenblock CH-100</td><td>BioSan</td><td>BS-010410-CAI</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-Schüttler Multitron</td><td>Infors HT</td><td>NC1666704</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (C3H7OH)</td><td>Fisher-Bioreagenzien</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff (N2)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetattetrahydrat (Mg(OAc)2 &bull; 4H2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7008.0100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette mit kreisförmigen Markierungen, 100 & Mikro; L</td><td>Marienfeld</td><td>2920116</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalshaker</td><td>Sanyo</td><td>Mir-S100C</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe PD 5201</td><td>Heidolph</td><td>523-52019-00</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td>PMSF ist der einzige Proteaseinhibitor, der in dieser Methode verwendet wird.</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Zentrifugenflaschen, 70 ml, 38 x 102 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Zentrifugenröhren, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Zentrifugenröhren, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>AppliChem</td><td>A3582.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Lach-Ner</td><td>UN1813</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Homogenisator</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000669-PR-240-A</td><td></td></tr><tr><td>Reaktionsröhren 3810X 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock-Röhren 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhre mit Schraubkappe, 2 mL</td><td>VWR</td><td>525-1146</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette 10 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>12-461-9208</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette 25 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>12-481-9102</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer NanoDrop 2000c</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer Ultrospec 2000</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>CGS 8162.39</td><td></td></tr><tr><td>Sukrose (C12H22O11)</td><td>Carl Roth</td><td>9097.1</td><td></td></tr><tr><td>Schwingschaufelrotor SW28</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelschaufelrotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>tRNA von E.coli MRE 600</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Gelbe Pipettenspitzen, 5-200 & Mikro; L</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>94300120</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro reassoziationstest zur messung der bildung von ribosomalen partikeln aus den 80er jahren mit salzgewaschenen ribosom-subeinheiten

In Vitro Reassociation Assay to Measure the Formation of 80S Ribosomal Particles Using Salt-washed Ribosomal Subunits

In vitro Reassoziationstest zur Messung der Bildung von ribosomalen Partikeln aus den 80er Jahren mit salzgewaschenen Ribosom-Subeinheiten

Ribosomes are molecular machines that are responsible for protein synthesis in all living cells. All ribosomes consist of two subunits. In eukaryotes, the ...

in-vitro-reassociation-assay-to-measure-formation-80s-ribosomal

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Die Kontamination von Zubereitungen der eukaryotischen Ribosomen mit herkömmlichen Methoden durch Co-Reinigung Nukleasen und Proteasen gereinigt negativ auf die nachgelagerten biochemische und strukturelle Analysen. Eine schnelle und einfache chromatographische Reinigungsverfahren wird verwendet, um dieses Problem unter Verwendung von Hefe Ribosomen als Modellsystem zu lösen.

Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

Wir beschreiben hier eine Technik, die inzwischen routinemäßig eingesetzt wird, um stabil gebundene Ribosomen entstehenden Kette Komplexen (RNC) zu isolieren. Diese Technik nutzt die Entdeckung, dass ein 17 Aminosäuren langes SecM "Verhaftung Sequenz" können Translationselongation in einem prokaryotischen aufzuhalten...

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energietransfer ist eine Methode, die die tRNA-Dynamik während der ribosomalen Proteinsynthese verfolgt. Durch die Verfolgung einzelner Ribosomen werden inhomogene Populationen identifiziert, die Aufschluss über Mechanismen geben. Diese Methode kann verwendet werden, um biologische Konformationsänderungen im Allgemeinen zu verfolgen, um dynamische Funktionsbeziehungen in vielen anderen komplexen Biosystemen aufzudecken. Einzelmolekülmethoden können...

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

Co-translationale Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei Modifikationen, Targeting-, Faltungs- und Montagepfaden der entstehenden Kette. Hier beschreiben wir Selective Ribosome Profiling, eine Methode zur in vivo, direkten Analyse dieser Wechselwirkungen im Modell Eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Globale Identifizierung von co-translationalen Interaktionsnetzwerken durch selektives Ribosomenprofiling

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Lernen Sie die in vitro-Reassoziation von Ribosomen-Untereinheiten zur Analyse von 80S-Partikelbildung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Untereinheiten-Interaktionen bei der Proteinbiosynthese.

In vitro Reassoziationstest zur Messung der Bildung von ribosomalen Partikeln aus den 80er Jahren mit salzgewaschenen Ribosom-Subeinheiten (Video) | JoVE Journal

In vitro Reassoziationstest zur Messung der Bildung von ribosomalen Partikeln aus den 80er Jahren mit salzgewaschenen Ribosom-Subeinheiten

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