Name: Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Lernen Sie die DNA-PAINT-Bildgebung für hochauflösende Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie auf einer rotierenden Scheibe. Dieses Protokoll ermöglicht tiefe Ganzellbilder ohne kundenspezifische Optik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2-Carbonsäure</td><td>Merck&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>3,4-Dihydroxybenzoesäure&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60& Mal; Apo NA 1.49 Objektivobjektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA Spin-Entsalzungssäule mit Größenausschlussharz & nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>89882</td><td>Zeba Spin Entsalzungskolonnen für Schritt 2.4</td></tr><tr><td>Accutase – Enzymzellablösungsmedium</td><td>Promo Cell</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) Anti-GFP gekoppelt mit individueller DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>Massive Photonik</td><td>Individuelles Produkt</td><td>Anti-GFP-Kandidat für Drosophila</td></tr><tr><td>Alpaca sdAb (1H1) Anti-GFP gekoppelt mit DNA</td><td>Massive Photonik</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3</td><td>Anti-GFP-Kandidat für NUP</td></tr><tr><td>Anti-Alpha-Tubulin (YL1/2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Massive Photonik</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, sekundäre sdAB F2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>BioLegend</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Merck&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Konische Zentrifugalröhre 15 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>Konische Zentrifugalröhre 50 mL</td><td>VWR International</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>Nikon</td><td></td><td>SDC-OPR-Mikroskop</td></tr><tr><td>Entsalzung von Spin-Säulen mit Sephadex G-25 (Größenausschlussharz zur DNA-Reinigung)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11743309</td><td>Marke: Cytiva. G-25-Spalten für Schritt 2.5</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Wasserfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Marck</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Serva</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>MP Biomedizin</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>Maleimid-PEG2-Succinimidyl&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>McCoys 5A-Medien</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-Morpholino)Ethanesulfonsäure)</td><td>Merck</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhren 0,5 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhren 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nanopteilchen 90 nm -Gold</td><td>Zytodiagnostik</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Orca Fusion-BT CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x-Lösung)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pierce 16 % Formaldehyd (w/v), methanolfrei</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>&nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-Dioxygenase & nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>natrium&nbsp; Hydroxid</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Puffer</td><td>VWR International</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR International</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltrations-Zentrifugalfiltereinheit, 100 kDa MWCO</td><td>Merck&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>Hersteller: Amicon Ultra</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Brunnen hoher Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-Slide VI 0.5 Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

ganzzell-superauflösungsbildgebung mittels dna-paint auf einer rotierenden scheibe konfokal mit optischer photonenumzuweisung

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

Um die Superauflösungs-Bildgebungsfähigkeiten des SDC-OPR-Systems (Abbildung 1A) zu demonstrieren, wurde seine In-Plane-Auflösung durch DNA-PAINT-Bildversuche (Abbildung 1B) an Kernporenkomplexen (NPCs) bewertet, die eine biologische Referenzstruktur17 darstellen. Abbildung 1C zeigt ein repräsentatives DNA-PAINT SDC-OPR-Bild von Nukleoporin 96 (Nup96), markiert mit monomerisch verstärktem grünem fluoreszierendem Protein (mEGFPs) und markiert mit DNA-konjugierten Anti-GFP-Nanokörpern in U2OS-Zellen. Die heranzoomten Panels zeigen die NUP-Unterstruktur, und Abbildung 1D zeigt gepaarte Nup96-Proteine (angezeigt durch Pfeile), die mit der erwarteten 8-fachen Symmetrie der Kernporen übereinstimmen. In Abbildung 1E wurde der euklidische Abstand zwischen Nup96-Paaren gemessen, indem sie ausgerichtet und das Querschnittshistogramm des summierten Bildes (n = 16 Paare) dargestellt wurden. Die Analyse zeigte eine Peak-zu-Peak-Trennung von (13 ± 2) nm (Abbildung 1E), was mit den Ergebnissen von EM-Modellen sowie der HILO- und TIR-Bildgebung23 übereinstimmt. Jeder Peak-Fit zeigte eine Standardabweichung von 4 nm, was die hohe Lokalisierungspräzision (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) bestätigte, die mit DNA-PAINT auf SDC-OPR erreicht wurde. Bemerkenswert ist, dass diese Präzision über das gesamte 53 × 53 μm² Sichtfeld erhalten wurde, was für konfokalbasierte Systeme außergewöhnlich ist.
Um die Fähigkeit zur Mehrfarbbildgebung zu demonstrieren, wurden Nup96, Mitochondrien und Mikrotubuli in U2OS-Zellen, DNA-kennzeichnungen für die Erfassung mit Exchange-PAINT18. Diese Technik verwendet orthogonale DNA-Imager-Stränge, die zu einem einzelnen Fluorophor konjugiert sind, sodass alle Ziele mit derselben Laserquelle angeregt werden können (Abbildung 2A). Anstatt Signale gleichzeitig zu empfangen, werden sie über sequentielle Bildrunden verteilt, was eine einfache Integration in jedes kommerzielle SDC-OPR-System ermöglicht. Abbildung 2B zeigt Nup96 in Blau mit einem Anti-GFP-Nanokörper, Mitochondrien in Rot mit einem sekundären Anti-TOM20-Antikörper und Mikrotubuli in Grün mit einem primären Anti-α-Tubulin-Antikörper. Bemerkenswert ist, dass die herausragende Einzelmolekül-Lokalisierungspräzision, die für die Einfarb-Nup96-Bildgebung erzielt wurde, über alle Ziele des Multi-Target-Experiments erhalten blieb und Lokalisierungspräzisionswerte von 3,9 nm für den NPC, 4,0 nm für α-Tubulin und 3,3 nm für Mitochondrien ergab (Abbildung 2B, Panel 1, 2 und 3).
Für die Bildgebung mit großem FOV wurden Mikrotubuli in HeLa-Zellen mit verschiedenen Vergrößerungen des SDC-OPR-Systems abbildet, kombiniert mit unterschiedlichen Kamera-Binning-Einstellungen, um Pixelgrößen zwischen 78 nm und 108 nm zu halten (Abbildung 3). Abbildung 3A zeigt das Mikrotubuli-Zytoskelett von 10 HeLa-Zellen, wobei Farben die Lokalisierungsgenauigkeit darstellen. Bei 1× Vergrößerung ist die durchschnittliche Lokalisierungsgenauigkeit deutlich schlechter als bei höheren Vergrößerungen (Abbildung 3B-D), wobei eine größere Variabilität beobachtet wird. Dies liegt an der reduzierten Laserleistungsdichte über dem größeren Sichtfeld, wo das Gaußsche Beleuchtungsprofil sichtbar wird, was zu einer verringerten Präzision gegenüber den Rändern des Sichtfelds führt. Dennoch ist das Erreichen einer durchschnittlichen Lokalisierungsgenauigkeit von 9,5 nm über das weitläufige 211 × 211 μm² FOV für konfokalbasierte Systeme beeindruckend und ermöglicht eine hochauflösende Untersuchung biologischer Heterogenität.
Schließlich wird die Möglichkeit der Bildgebung ganzer Zellen demonstriert, indem DNA-PAINT-Bilder des Mikrotubulinetzwerks in fixierten HeLa-Zellen mit einem konfokalen Volumen von ~500 nm Dicke und 1 μm Z-Step unter Verwendung der höchsten Vergrößerung des Systems (4×, 53 × 53 μm² Sichtfeld) aufgenommen werden. Abbildung 4A zeigt die Einzelmoleküll-Rekonstruktionsbilder für jede z-Ebene zusammen mit der entsprechenden Lokalisierungsgenauigkeit und NeNA-Werten. Zusätzlich wird in Abbildung 4C eine farbgerenderte Visualisierung des Mikrotubulinetzwerks in der HeLa-Zelle dargestellt. Mit zunehmender Tiefe nimmt die Anzahl der detektierten Photonen aufgrund von Streuung und optischen Aberrationen ab, was zu einer geringeren Lokalisierungsgenauigkeit sowohl für die Lokalisierungsgenauigkeiten aus der Cramér-Rao-Untergrenze (CRLB) (Abbildung 4A, rechts) als auch für die mit der NeNA-Metrik berechneten Genauigkeiten führt. Dennoch ermöglicht die hohe Photonensammlung, die durch das SDC-OPR-System möglich ist, σSMLM ≤ 10 nm für eine Bildtiefe von bis zu 9 μm mit enger Verteilung. Tatsächlich wurden doppelwandige filamentöse Mikrotubuli-Strukturen in verschiedenen Tiefen klar aufgelöst: nahe der Deckungszell-Grenzfläche, an Zwischenachsen und oben in der Zelle, mit einem Spitzenabstand zwischen 30 nm und 40 nm (Abbildung 4C), was mit den gemeldetenWerten 24 übereinstimmt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit des SDC-OPR, hochauflösende Bildgebung über große Sichtfelder und über die gesamte Zellhochhöhe zu liefern.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1: In-plane Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie verschiedener Zellproben und mehrfarbige Superauflösungsbildgebung. (A) Schaltplan des Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment (SDC-OPR)-System, mit einem Mikrolinsenarray, das zur Maximierung der Photonensammlung entwickelt wurde. (B) Schematik von DNA-PAINT: Fluoreszierend markierte DNA-Stränge, bekannt als Imager-Stränge, hybridisieren vorübergehend mit komplementären DNA-Sequenzen (Docking-Strängen), die am Antikörper/Nano verankert sind und das gewünschte Protein anvisieren. Diese kurzlebigen Bindungsereignisse erzeugen Fluoreszenzsignale, die wie stochastisches Blinzeln erscheinen. (C) Repräsentatives DNA-PAINT-Bild auf dem SDC-OPR-System mit 4× Vergrößerung des NPC der U2OS-Zellen. Die hochauflösende Fähigkeit wird im Inset demonstriert, wo einzelne NPCs eindeutig aufgelöst sind. (D) SDC-OPR-verbesserte DNA-PAINT ermöglicht die Visualisierung einzelner NPCs, wobei weiße Pfeile charakteristische Nup96-Proteinpaare innerhalb der Porenarchitektur hervorheben. (E) Verteilung der Abstandsmessungen zwischen Nup96-Dimern (n=16 Paare) innerhalb einzelner NPC-Symmetrieeinheiten. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a> 
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Exchange-PAINT für mehrfarbige Bildgebung mit einem SDC-OPR-Mikroskop. (A) Schaltplan von Exchange-PAINT von drei Zielen, sequentiell abgebildet. Drei Proteinziele wurden entweder mit DNA-funktionalisierten Antikörpern, Fab-Fragmenten oder Nanokörpern markiert. Die Cy3B-Imager-Stränge wurden sequentiell nach Strängtyp mit Spülschritten zwischen den Bildrunden abgebildet. (B) Dreifarbige Exchange-PAINT-Bildgebung von U2OS-Zellen mittels SDC-OPR-Mikroskopie mit 4× Vergrößerung, die Mikrotubuli (rot; beschriftet mit DNA-konjugiertem Anti-α-Tubulin), Mitochondrien (grün; TOM20-gezielte DNA-Nanokörper) und NPC (blau; mEGFP-markiert Nup96 mit Anti-GFP-DNA-Nanokörpern). Maßstabsanzeige: 5 μm. Der heranzoomte Bereich betont die verbesserte Auflösung des SDC-OPR-Systems, wobei der Fokus auf (1) Mitochondrien, (2) Mikrotubuli und (3) NUP liegt. Skalenbalken = 1 μm. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: DNA-PAINT-Bildgebung innerhalb großer Sichtfelder mit einem SDC-OPR-Mikroskop. Mikrotubuli-DNA-PAINT-Bilder (Anti-α-Tubulin-Labeling), aufgenommen bei mehreren Vergrößerungen: (A) 1× Vergrößerung und 1 Binning (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2,8× und 2 Binning (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× Vergrößerung und 4 Binning (FOV 53 × 53 μm²). Farbe stellt die Lokalisierungsgenauigkeit von 0–16 nm im Fall von 1x Vergrößerung und 0–4 nm bei anderen an. (D) Lokalisierungsgenauigkeit gemessen in unterschiedlichen Abständen (in μm) vom Zentrum des FOV bei Vergrößerungen von 1× (rot), 2,8× (gelb) und 4× (grün). Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Ganzzellige DNA-PAINT-Bildgebung. (A) Links. Volumetrische Mikrotubuli-Bildgebung in HeLa-Zellen mittels DNA-PAINT, aufgenommen mit SDC-OPR bei 4× Vergrößerung, wobei axiale Schnitte von z = 0 bis 9 μm (1 μm Schritte) gezeigt werden. Jede Ebene zeigt z-Position , Lokalisierungsgenauigkeit und NeNA-Metrik an. Skalenbalken: 5 μm (xy). Richtig. Lokalisierungspräzision versus Durchdringungstiefe für alle Ebenen. (B) 3D-Darstellung des Mikrotubulinetzwerks auf derselben HeLa-Zelle wie in (A). Farbe stellt die Penetrationstiefe von 0 bis 9 μm dar. (C) Eingezoomte Bilder der markierten kleinen Bereiche aus jeder in (A) angegebenen Durchdringungstiefe. Diese Abbildung wurde aus Zaza et al.14 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

Unser Protokoll verwendet DNA-PAINT auf einem rotierenden Scheiben-konfokalen Mikroskop mit optischer Photonen-Neuzuweisung, um Tiefenbeschränkungen zu überwinden. DNA-PAINT erreicht heute ein extrem hohes Auflösungsniveau mit Multiplexen und quantitativen Fähigkeiten und übertrifft damit andere SMLM-Techniken wie PALM und STORM. Zunächst verwenden Sie ein rotierendes Scheiben-Konfokalsystem, das mit einer optischen Photonen-Neuzuweisungseinheit und einer sCMOS-Kamera ausgestattet ist.Starten Sie das System 30 Minuten vor der Bildgebung, indem Sie Mikroskop, Kamera und Laser einschalten. Dann starte den Computer. Warte, bis die NIS-Elements-Software vollständig geladen ist.Wählen Sie nun den entsprechenden Bildgebungsmodus in NIS-Elements aus, indem Sie SoRa Spinning Disk auswählen, bevor Sie die Erfassungsparameter setzen. Wählen Sie das 60x Apo numerische Apertur-1,49-Ölimmersionsobjektiv, um den Nachweis einzelner Molekülereignisse zu maximieren. Wählen Sie dann die passende Vergrößerung basierend auf Objektiv, Kameraeinstellungen und Probe aus.Passen Sie die Kamerabiegung entsprechend an, um an die gewählte Vergrößerung anzupassen. Stellen Sie die Belichtungszeit für die DNA-PAINT-Aufnahme ein. Konfigurieren Sie nun die Laserwellenlänge, die Laserleistung und das Filterrad entsprechend dem Farbstoffspektrum des Imagers.Um die Laserleistung nach dem Objektiv aufzuzeichnen, platzieren Sie einen kalibrierten Laser-Leistungsmesssensor auf der Mikroskopstufe in der Nähe der Probenebene und zeichnen Sie die gemessene Leistung auf. Als Nächstes tragen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das saubere 60x Apo numerische Aperture 1,49 Ölobjektiv auf. Befestigen Sie die vorbereitete immungefärbte Zellprobe mit einem Stufenadapter auf der Mikroskopstufe, um Drift zu minimieren.Schalte in den Hellfeldmodus um und fokussiere dich auf die Glasebene mit Nanopartikeln als Referenz. Dann aktiviere das Perfect Focus System, um während der Erfassung den Fokus zu halten. Mit aktivem Perfect Focus System wird die Anregung vorübergehend auf den grünen fluoreszierenden Proteinkanal umgestellt, um die optimale Brennebene zu identifizieren.Benutze während dieses Schritts eine geringe Laserleistung. Definiere den Namen des Experiments und den Speicherpfad. Kreuzen Sie das Zeitkästchen an, um Intervall, Dauer und Anzahl der Schleifen einzustellen.Setze das Intervall auf Keine Verzögerung und gib die Anzahl der Schleifen ein, die der Gesamtzahl der Frames entspricht. Stelle sicher, dass das PFS-Feld unten ausgewählt ist. Gehen Sie zu den zuvor definierten SoRa-Erregungseinstellungen zurück und drücken Sie auf Jetzt ausführen.Erfassen Sie 15.000 bis 20.000 Bilder für das erste Protein, wobei eine Integrationszeit von 300 Millisekunden verwendet wird. Für die Bildanalyse laden Sie den deconvolutierten Bildstapel in das Picasso-lokalisierte Modul. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren und dann Parameter und geben Sie die kameraspezifischen Parameter gemäß den Herstellerspezifikationen ein.Als Nächstes wird die Kastenseite auf sieben gesetzt, um die Lokalisierungsgenauigkeit der einzelnen Molekül zu optimieren. Wählen Sie einen geeigneten Mindest-Nettogradientenwert und aktivieren Sie die Vorschau, um erkannte Lokalisierungen zu visualisieren. Passen Sie die Gradientenschwelle an, um Hintergrunderkennungen zu minimieren.Wählen Sie nun Analysieren und dann Lokalisieren, um mit der Spot-Identifikation und Anpassung über alle Frames zu beginnen. Laden Sie das resultierende HDF5 in das Picasso Render-Modul, um die rekonstruierte Lokalisierungskarte zu visualisieren. Wähle Postprocess und dann Undrift by RCC.Geben Sie einen Anfangssegmentierungswert ab 1.000 ein, um ein xy-Driftdiagramm zu erhalten. Wiederhole das mit niedrigeren Segmentierungswerten, um die Driftkorrektur zu verbessern. Klicken Sie auf Datei und Speichere Lokalisierung, um die driftkorrigierte Lokalisierungsdatei vor dem Schließen des Rendermoduls zu speichern.Laden Sie nun die driftkorrigierte Datei in das Picasso-Filtermodul und wenden Schwellenwerte basierend auf Lokalisierungsgenauigkeit, Punktstreuungsfunktionen, Photonenzählungen und anderen Qualitätsmetriken an. Klicken Sie auf Datei und Speichere Lokalisierung, um die gefilterte Lokalisierungsdatei vor dem Schließen des Filtermoduls zu speichern. DNA-PAINT-Bildgebung von Nukleoporin 96, markiert mit monomer-verstärktem grünem fluoreszierendem Protein in U2OS-Zellen, erzeugte ein klares, superaufgelöstes Muster des nuklearen Porenkomplexes im gesamten Sichtfeld.Herangezoomte Ansichten zeigten gepaarte Nukleoporin-96-Untereinheiten, die mit der erwarteten achtfachen Symmetrie der Kernporen angeordnet sind. Die Messung des euklidischen Abstands zwischen ausgerichteten Nukleoporin-96-Paaren zeigte einen Spitzenabstand von 13 plus/minus 2 Nanometern. Nukleoporin 96, Mitochondrien und Mikrotubuli wurden gleichzeitig in U2OS-Zellen mit erhaltener Einzelmolekül-Lokalisationsgenauigkeit über alle Ziele hinweg sichtbar gemacht.Großes Sichtfeld Die Bildgebung von Mikrotubuli in HeLa-Zellen zeigte, dass die Lokalisierungsgenauigkeit mit Vergrößerung und Feldgröße variierte, wobei bei niedrigerer Vergrößerung eine geringere Präzision beobachtet wurde. Höhere Vergrößerungen führten zu einer verbesserten und gleichmäßigeren Lokalisierungsgenauigkeit im Vergleich zur 1x-Vergrößerung. Die Ganzzellbildgebung wurde durch DNA-PAINT-Aufnahme des Mikrotubuli-Netzwerks über mehrere axiale Ebenen über die gesamte Zelltiefe demonstriert.Die Lokalisierungspräzision nahm allmählich mit zunehmender Bildtiefe ab. Doppelwandige Mikrotubulistrukturen wurden an mehreren axialen Positionen mit Spitzenabständen zwischen 30 Nanometern und 40 Nanometern aufgelöst. Unser Protokoll ermöglicht eine tiefe DNA-PAINT-Bildgebung von Zellen und Geweben ohne Auflösung zu beeinträchtigen, und verwendet einfache und kommerziell erhältliche Optiken.Hochauflösende DNA-PAINT funktioniert hauptsächlich unter TIRF oder hoher Beleuchtung und beschränkt die Bildtiefe auf nur wenige Mikrometer. Unsere Ergebnisse machen DNA-PAINT für viele Labore zugänglich und ermöglichen so nanoskalige Bildgebung in Zellen und Gewebe in der Tiefe.

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

In diesem Protokoll wird erläutert, wie bakterielle Proben für die dreidimensionale Bildgebung vorbereitet und montiert werden und wie die dreidimensionale Form von E. coli aus diesen Bildern rekonstruiert wird.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Die hochauflösende Mikroskopie kann einen detaillierten Einblick in die Organisation von Komponenten innerhalb des synaptonemalen Komplexes bei der Meiose geben. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Auflösung einzelner Proteine des Synaptonemalkomplexes Caenorhabditis elegans .

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Lernen Sie die DNA-PAINT-Bildgebung für hochauflösende Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie auf einer rotierenden Scheibe. Dieses Protokoll ermöglicht tiefe Ganzellbilder ohne kundenspezifische Optik.

Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

Weitere Videos entdecken