Entwicklung und Standardisierung einer ex vivo Mikromethode zur intrazellulären Quantifizierung von Vincristin in primären ALLEN Zellen mittels LC-MS/MS

Unser Ziel ist es, intrazelluläres Vincristin in klinisch relevanten Proben zu messen und Wechselwirkungen von Arzneimittelzellen zu untersuchen. Die aktuelle experimentelle Herausforderung ist die Optimierung der Inkubationszeit im gesamten Modell. Darüber hinaus begrenzt die modellabhängige Arzneimittelanpassung die Robustheit, insbesondere in Primärpatientenproben.

Zu Beginn tauen Sie die kryokonservierte Zellprobe auf, indem Sie das Fläschchen vorsichtig in einem Becher mit 15 Millilitern destilliertem Wasser bei 37 Grad Celsius schwenken, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens in ein 50-Milliliter-konisches Rohr mit 15 Millilitern sterilem 1X PBS mit einer sterilen Einweg-Pasteur-Pipette. Setze das Rohr für fünf Minuten bei Zimmertemperatur in die auf 300 G eingestellte Zentrifuge.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand durch Invertieren des Rohrs in einer einzigen gleichmäßigen Bewegung entsorgt. Nun wird das Zellpellet in 10 Millilitern AIM V Medium mit einer Einweg-Pasteur-Pipette wieder suspendiert. Zähle lebensfähige Zellen mit einem automatischen Zähler und messe die durchschnittliche Zellgröße.

Berechnen Sie das benötigte Volumen, um 2,5 mal 10 hoch zur Potenz von sechs lebensfähigen Zellen mit einem einfachen Verhältnis basierend auf der gemessenen Zellkonzentration zu erhalten. Vortex die Vincristin-Fondlösung lange vor der Verwendung. Gib AIM V Medium zu einem zwei Milliliter Mikrorohr, gefolgt von 2,5 mal 10 auf die Leistung von sechs Zellen, und dann das erforderliche Volumen Vincristinlösung.

Vortex kurz und das Rohr fünf Sekunden lang drehen, um Flüssigkeit aus der Kappe zu sammeln. Als Nächstes inkubieren Sie die offenen Mikroröhren bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für drei Stunden. Nach der Inkubation schließen Sie die Rohrdeckel und zentrifugieren Sie die Proben bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Entsorge das Supernatant vorsichtig mit einer Pipette. Gib dann einen Milliliter PBS bei Raumtemperatur in die Tube. Nachdem Sie die Zentrifugations- und Waschschritte wiederholt haben, entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Supernatanten mit einer Pipelette.

Das Pellet in 100 Mikrolitern PBS und Vortex wieder suspendieren, bis das Pellet vollständig wieder suspendiert ist. Gib nun 400 Mikroliter kaltes Methanol mit 0,1 mikromolaren Vinblastin bei minus 20 Grad Celsius direkt zur Probe und vermeide dabei den Kontakt mit den Röhrenwänden. Lagern Sie die Proben über Nacht bei minus 80 Grad Celsius.

Kühlen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius vor, bevor Sie die Proben aus dem Minus-80-Grad-Gefrierschrank entnehmen. Unmittelbar nach dem Herausnehmen der Proben aus dem Gefrierschrank zentrifugieren Sie sie bei 13.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend werden 300 Mikroliter des Supernatanten mit einer Pipette in ein 1,5-Milliliter-Mikrorohr übertragen.

Trocknen Sie die Proben vollständig, indem Sie sie für eine Stunde und 40 Minuten in einen Vakuumkonzentrator mit 45 Grad Celsius legen. Nach dem Trocknen werden Sie jedes Pellet mit einer Pipette in 400 Mikrolitern Wasser mit 0,1 % Ameisensäure wieder suspendiert. Vortexen vorsichtig, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist.

Zentrifugiere die Proben jetzt erneut bei 13.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 300 Mikroliter des Supernatanten in ein zwei-Milliliter-Schraubfläschchen zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. Auf dem Startbildschirm der Software öffnen Sie die Musterliste und erstellen Sie eine neue Liste, indem Sie die Probennamen, Injektionsvolumina, Fährchenpositionen und die zu verwendende Methode eingeben.

Stellen Sie ein Fläschchen mit ultrareinem Wasser in das Autosampler-Tray und markieren Sie dieses Fläschchen als Leerlauf in der Probenliste. Führe die Leerlaufbahn zwischen jedem Satz dreifacher Injektionen durch, um eine Übertragung zu vermeiden. Wählen Sie die gewünschten Zeilen in der Beispielliste aus und beginnen Sie mit der Datenerfassung, indem Sie auf Ausführen klicken und mit OK bestätigen. Nach Abschluss des Durchlaufs wählen Sie eine Probe aus den Ergebnissen aus und sehen Sie sich die Chromatogramme an, indem Sie im oberen Menü auf das Chromatogramm klicken.

Schließlich klickt man auf dem Startbildschirm auf Ziel-Links. Wähle die Dateien aus, die gerade ausgeführt wurden, und klicke auf Bearbeiten. Wählen Sie die Vincristine-Methode und klicken Sie auf OK, um Ausgabetabellen zu erstellen.

Die chromatographische Analyse primärer akuter lymphoblastischer Leukämie, von Patienten abgeleiteter Xenograftzellen, die drei Stunden lang mit einem mikromolaren Vincristin inkubiert wurden, zeigte konstant einen symmetrischen und gut aufgelösten VCR-Peak nach 2,85 Minuten, was eine angemessene Retention und minimale Matrixinterferenz bestätigte. Kalibrierungskurven für Vincristin, die in AIM V Media erzeugt wurden, zeigten eine starke Linearität über Konzentrationen von 0,001 bis 10 Mikromolar. Ähnlich gilt: Wenn zweimal zehn hoch in die Potenz von sechs RS4 ist; Es wurden 11 Zellen hinzugefügt, eine lineare Reaktion von 0,01 auf ein Mikromolar wurde beobachtet.

Die Zeitverlaufanalyse der Vincristinakkumulation ergab, dass RS4; 11 Zellen zeigten ein Plateau im Vincristin-Vinblastin-Verhältnis zwischen zwei und drei Stunden mit einem moderaten Anstieg nach vier und fünf Stunden, während primäre PDX-Zellen bei zwei Stunden ihren Höhepunkt erreichten und danach abnahmen, was die Auswahl von drei Stunden als ausgewogene Inkubationszeit unterstützte. Die normalisierte Vincristin-Akkumulation variierte über sechs PDX-Patientenproben, und es wurde eine positive Korrelation zwischen unnormalisiertem Vincristin und Vinblastin-Verhältnissen und dem durchschnittlichen Zellvolumen beobachtet. Die Fragmentierungsanalyse bestätigte, dass der Basis-Peak von Vincristin mit dem Vorläufer-Ion bei einem Masterladungsverhältnis von 413,38 entsprach, was ein Quantifizierungsion von 392,47 und eine Bestätigungsion bei 383,38 bei 40 Volt Kegelenergie und 16 Volt Kollisionsenergie erzeugte.

Unser Protokoll überwindet die Einschränkungen indirekter Ansätze, indem es eine direkte und sensitive intrazelluläre Arzneimittelmessung hauptsächlich in Leukämiezellen ermöglicht. Unser Ansatz erleichtert die direkte Messung des intrazellulären Vincristin, selbst wenn die Zellstimmen gering sind. Zukünftig werden wir untersuchen, ob Unterschiede in der intrazellulären Arzneimittelakkumulation mit In-vitro-Resistenzen assoziiert sind, und verwandte Mechanismen untersuchen.