Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen
10. April 2026
Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.
Wir untersuchen die Entwicklung der menschlichen endokrinen Bauchspeicheldrüse mit Stammzell-abgeleiteten Ösen, um die genetische Grundlage von Diabetes zu verstehen. Die traditionelle Nierenkapseltransplantation ist hochinvasiv. Das intramuskuläre Transplantationsprotokoll bietet eine einfachere, reproduzierbare und minimalinvasive Alternative.
Zu Beginn fügen Sie 0,5 Milliliter 5%-anti-haftende Lösung hinzu, um den Boden einer 24-Well-Mikrowellplatte mit invertierten pyramidalen Mikrowellen zu bedecken. Zentrifugiere die Platte bei 1.300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann untersuchen Sie die Mikrobrunnen unter dem Mikroskop auf Luftblasen.
Nach dem erneuten Zentrifugieren der Platte, um eingeschlossene Luft zu entfernen, aspirieren Sie die Anti-Haftlösung. Wasche dann jede Methode gut mit 0,5 Millilitern PBS und wiederhole den Waschschritt noch einmal. Als Nächstes werden die kultivierten Bauchspeicheldrüsenvorläufer, die aus hPSCs entwickelt wurden, mit einem Milliliter PBS und 0,5 millimolaren EDTA gewaschen.
Aspiratiere das PBS mit 0,5 millimolaren EDTA und decke die Bohrlöcher mit Trypsin ab. Dann brütet man bei 37 Grad Celsius für acht bis zwölf Minuten. Verdünnen Sie das Trypsin mit zwei Bänden DMEM/F12 oder PBS und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipetten.
Übertragen Sie die Suspension in ein konisches Rohr und gehen Sie sofort zum nächsten Schritt über. Zentrifugiere die Suspension bei 200 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie vorsichtig das Supernatant ab und lassen Sie das Pellet vorsichtig in vorgewärmtem S4-Medium wieder aufhängen.
Als Nächstes aspirieren Sie das PBS aus den Mikrowell-Schalen. Geben Sie vorsichtig 1,25 Milliliter der suspendierten Zellen zu jedem Brunnen der Mikrowell-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 g für drei Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen gleichmäßig in den Mikrobrunnen zu verteilen.
Übertragen Sie die Mikrowell-Platte vorsichtig in einen befeuchteten Inkubator. Um Medienwechsel mit Differenzierungsmedien vorzunehmen, aspirieren und dosieren Sie das Medium vorsichtig entlang der Bohrlochwände, um Turbulenzen und das Verdrängen von Zellclustern aus Mikrowellen zu verhindern. Nachdem die entsprechende Menge der erzeugten Cluster in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen wurde, schließen Sie die Spritze an die Nadelrohrbaugruppe an und füllen sie mit S7-Medium.
Saugen Sie die Cluster direkt aus dem Mikrozentrifugenrohr in den Schlauch. Falten Sie den Schlauch in der Mitte und führen Sie den gefalteten Abschnitt in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze ein. Dann steckt man die Spitzen-Nadel-Einheit in ein 15-Milliliter-Kegelrohr und befestigt die Enden mit Klebeband am Rohrrand.
Zentrifugiere das Rohr bei 100 g für zwei Minuten bei 4 Grad Celsius, um die Cluster zu verdichten, und stelle das Rohr sofort auf Eis. Um die Cluster in die narkosierten NOD-Scid-Gammamäuse zu transplantieren, wird die mediale Seite des rechten Beins unterhalb des Knies abgeschnitten und mit 70 % Ethanol desinfiziert. Dann lösen Sie den Schlauch von der Pipettenspitze und verbinden Sie ihn mit der Spritze.
Schneiden Sie den Schlauch nahe an die verdichteten Cluster und befestigen Sie ihn am stumpfen Ende der Nadel. Drücken Sie die Kochsalzlösung, bis der erste Cluster die Spitze der Nadel erreicht. Dann positioniere die Maus in Bauchlage, lehne dich zur rechten Seite und strecke das rechte Bein aus.
Führen Sie die Nadel vier bis fünf Millimeter tief in das mediale Fach des rechten Oberschenkels zwischen Adduktor- und Gracilismuskel ein. Dann injizieren Sie die Cluster, während Sie die Nadel um etwa drei Millimeter zurückziehen. Drehen Sie die Spritze, ziehen Sie die Nadel heraus und lassen Sie die Maus sich erholen.
Nach der Transplantation sechs Wochen nach der Transplantation und Gewebeschnitt wird eine Immunfärbung durchgeführt, um nachfolgende bildgebende Analysen zu ermöglichen. Einzelzellige Suspensionen von pankreatischen Vorläufern der Stufe vier wurden in Mikrowellplatten eingesetzt, um größengesteuerte dreidimensionale Aggregate zu erzeugen. Innerhalb von 24 bis 48 Stunden bildeten sich kompakte kugelförmige Haufen.
Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte das Vorhandensein von PDX1- und insulinexprimierenden Zellen in den Reporter-hPSC-Linien. Nach sechs Wochen wurde die Transplantationsstelle makroskopisch mit augenähnlichen Massen im Muskel sichtbar dargestellt. Nach der Exzision konnten Explants unter einem Stereomikroskop als blasse kugelförmige Bindungsstrukturen identifiziert werden.
Ein robuster Nachweis von C-peptidpositiven Zellen wurde bei transplantierten Tieren beobachtet. Die Insulinfärbung bestätigte das Vorhandensein menschlicher betaähnlicher Zellen im Transplantat. Glukagon- und Somatostatin-positive Zellen wurden nachgewiesen, was auf die Erhaltung der Alpha- und Delta-Zellpopulationen hinweist.
Dieses Protokoll erleichtert funktionelle Assays in vivo sowie die Bewertung des Überlebens und der Reifung transplantierter menschlicher Transplantate. Die wichtigste Überlegung ist die Sicherstellung einer hochwertigen Stammzelldifferenzierung und einer sanften Zellbehandlung während der Clusterbildung, um die Lebensfähigkeit zu maximieren und ein gutes Überleben der Zellen zu gewährleisten. Diese Modelle erleichtern die Untersuchung der genetischen Mechanismen, die monogenem Diabetes und Betazelldysfunktion zugrunde liegen.
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Übersicht
Dieser JoVE-Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) abgeleiteten pankreatischen SC-Inseln in immundefiziente Mäuse vor. Die Methode bietet eine weniger invasive Alternative zur Transplantation unter die Nierenkapsel oder subkutan und ermöglicht einen einfachen chirurgischen Zugang sowie eine zuverlässige Gewinnung des Transplantats. Das Protokoll erlaubt die Beurteilung der Inselfunktion mittels in-vivo-Glukose-stimulierter Insulinsekretion (GSIS) nach oraler Glukosegabe und erleichtert anschließende histologische Analysen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerative Medizin
- Stammzelltherapie
- Diabetesforschung
Hintergrund
- hPSC-abgeleitete pankreatische endokrine Zellen versprechen Fortschritte für die Zelltherapie bei Diabetes und die Krankheitsmodellierung.
- Aktuelle Transplantationsstellen wie die Nierenkapsel oder der subkutane Raum weisen technische oder physiologische Einschränkungen auf.
- Die Untersuchung der Reifung und Funktion von aus Stammzellen abgeleiteten Inseln im physiologischen Kontext erfordert häufig eine In-vivo-Implantation.
- Es besteht Bedarf an reproduzierbaren und leicht zugänglichen Transplantationsstellen, die eine Entnahme des Transplantats und eine funktionelle Beurteilung ermöglichen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die intramuskuläre Transplantation von aus hPSCs abgeleiteten SC-Inseln in immundefiziente Mäuse bereitzustellen.
- Die Beurteilung der Insel-Einheilung, des Überlebens und der Funktion an einem minimalinvasiven Transplantationsort zu ermöglichen.
- Die funktionelle Bewertung mittels in-vivo-GSIS und histologischer Analyse nach der Transplantation zu unterstützen.
- Einen reproduzierbaren Rahmen für die präklinische Diabetesforschung unter Verwendung von aus Stammzellen abgeleiteten Inseln zu etablieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung und Verdichtung von aus hPSCs abgeleiteten pankreatischen SC-Insel-Clustern.
- Transplantationschirurgie in den Muskel von immundefizienten Mäusen.
- In-vivo-Beurteilung der glucosestimulierten Insulinsekretion (GSIS) nach oraler Glucosagabe.
- Gewinnung des Transplantats und histologische Analyse zur Bewertung nach der Transplantation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einheilung und Überlebensfähigkeit von aus hPSCs abgeleiteten Inseln an der intramuskulären Transplantationsstelle.
- Nachweis funktionaler Insulinsekretion als Reaktion auf eine Glukosebelastung mittels in-vivo-GSIS.
- Zuverlässige Gewinnung der Transplantate für die histologische Analyse zur Bestätigung der Inselstruktur und der Markerexpression.
- Veranschaulichung einer reproduzierbaren, minimalinvasiven Methode für präklinische Studien zur Inseltransplantation.
Schlussfolgerungen
- Die intramuskuläre Transplantation ist ein geeigneter und leicht zugänglicher Ort für die Einpflanzung von aus hPSCs gewonnenen Inseln bei Mäusen.
- Das Verfahren ermöglicht die funktionelle Evaluierung von Stammzell-abgeleiteten Inseln mittels in-vivo-GSIS.
- Die Gewebeentnahme ermöglicht eine umfassende histologische und molekulare Analyse nach der Transplantation.
- Dieses Protokoll stellt ein reproduzierbares präklinisches Modell zur Voranbringung der Forschung zu Zelltherapien bei Diabetes bereit.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die intramuskuläre Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen abgeleiteten pankreatischen endokrinen Zellen bietet ein minimalinvasives, reproduzierbares präklinisches Modell für die Entwicklung einer Zelltherapie bei Diabetes. Dieser Ansatz ermöglicht die funktionelle Beurteilung von aus Stammzellen abgeleiteten Inseln mittels in-vivo-Glukose-stimulierter Insulinsekretion und erlaubt eine zuverlässige Gewebeentnahme für nachgeschaltete Analysen, wodurch wesentliche Einschränkungen herkömmlicher Transplantationsstellen behoben werden. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der präklinischen Bewertung, indem sie einen physiologischen Kontext für die Reifung und Funktion der Inseln bietet, gleichzeitig den chirurgischen Zugang verbessert und die Belastung der Versuchstiere verringert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Beurteilung der funktionellen Reifung von aus Stammzellen abgeleiteten Inseln in einem physiologischen Kontext.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch zuverlässige Einheilung und glucose-responsive Insulinsekretion in immundefizienten Mäusen.
- Strategischer Wert: Fördert die Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, indem reproduzierbare funktionelle Endpunkte vor der Optimierung der Leitverbindungen bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem funktionelle Inselzell-Engraftment etabliert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert Transplantationsverfahren, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in präklinischen Studien sicherzustellen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Bereitschaft von Assays, indem quantitative funktionelle Ausgaben mittels in-vivo-GSIS zur Evaluierung von Wirkstoffeffekten ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Behält die Krankheitsrelevanz bei, indem die Funktion menschlicher Inseln in vivo modelliert wird, und unterstützt die translationale Abstimmung von Biomarkern.
- Operativer Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente Gewebeentnahme und histologische Analyse.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem funktionale und strukturelle Daten zur Inselzell-Engraftment und -Reifung bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den Entdeckungsprozess integriert, indem sie die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase unterstützt, die Standardisierung von Assays für das Screening ermöglicht und funktionelle Endpunkte liefert, die Entscheidungen zur Identifizierung von Leitverbindungen und zur präklinischen Weiterentwicklung informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Beurteilung der Inselzellfunktion an einem physiologischen Transplantationsort.
- Screening: Verbessert die Bereitschaft von Assays durch standardisierte Transplantation und reproduzierbare Messungen der glucosestimulierten Insulinsekretion.
- Analysen: Ermöglicht quantitative Messungen abhängiger Variablen mittels in vivo GSIS, um die Transplantatfunktion unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem histologische und molekulare Analysen entnommener Transplantate zur Beurteilung der Reifung ermöglicht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare präklinische Plattform für iterative Entwicklungs- und Testzyklen in der stammzellbasierten Therapie der Diabetesentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bezüglich Funktion und Reifung von aus Stammzellen gewonnenen Inseln reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Transplantationsverfahren über verschiedene Forschungsstandorte hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige funktionelle Daten bereitgestellt werden, wodurch biologische Risiken in fortgeschrittenen Stadien von Diabetesprogrammen verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch reproduzierbare Einheilung und funktionelle Validierung von aus Stammzellen gewonnenen Inseln.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Differenzierung von Stammzellen, mikrochirurgischen Transplantationstechniken und in vivo Stoffwechseltests.
- Benötigt eine sterile chirurgische Infrastruktur, Systeme zur Glukosebelastung und Insulinnachweisverfahren für funktionelle Messungen.
- Setzt eine Standardisierung zwischen den Teams für Zellverarbeitung, Chirurgie und Analytik voraus, um konsistente Ergebnisse sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene immundefiziente Mausstämme und Zeitpläne der Inselzellreifung.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit postoperativer Überwachung und Verfahren zur Gewebeentnahme, die die Durchsatzkapazität bei großangelegten Studien beeinträchtigen können.
