Verfahren zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Eintrittsinhibitoren als potenzielle antivirale Mittel mittels MLV-basierten Pseudoviren

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, Inhibitoren zu identifizieren, die den SARS-CoV-2-Eintritt mithilfe von Pseudovirussystemen blockieren. Die Untersuchung des SARS-CoV-2-Eintritts erfordert häufig Labore mit hoher Biosicherheit, typischerweise BSL-3. Dieses Protokoll ermöglicht ein sicheres antivirales Screening, das in Pseudoviren in Standard-BSL-2-Laboren eingesetzt wird.

Zu Beginn werden Sie eine Sechs-Wellen-Gewebekulturplatte in den Biosicherheitsschrank gesetzt und 7,5 mal 10 mit der Potenz von fünf HEK 293-abgeleiteten Zellen pro Bohrloch in zwei Millilitern vollständigen Mediums ausgesät. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Am folgenden Tag bestätigen Sie, dass die Zellen etwa 50 bis 60 % Konfluenz erreicht haben.

Am nächsten Tag bereiten Sie die Polyethylenimin- oder PEI-Lösung vor, indem Sie fünf Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter PEI-Material zu 50 Mikrolitern reduziertem Serummedium in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. In einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr wird die DNA-Lösung hergestellt, indem 2,5 Mikrogramm GFP, das Plasmid exprimiert, zu 50 Mikrolitern desselben Mediums hinzugefügt wird. Mischen Sie jede Röhre kurz durch Vortexen, dann für fünf Sekunden abdrehen und bei Raumtemperatur inkubieren.

Während der 10-minütigen Inkubationszeit werden das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen der sechs-Brunnen-Platte entfernt, ohne die Zellmonoschicht zu stören, und jeweils einen Milliliter vollständiges Transfektionsmedium ohne Antibiotika hinzugefügt. Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter der DNA-Lösung in das Rohr mit der PEI-Lösung gegeben. Schnell durch sechsmaliges Pipettern mischen und genau drei Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.

Dann fügen Sie den PEI-DNA-Komplex schnell tropfweise in den entsprechenden Brunnen ein. Nun versiegeln Sie die Ränder der Platte mit Parafilm und zentrifugieren Sie bei 1000 G bei Raumtemperatur 30 Minuten lang ohne Unterbrechung mit einem Schwenkrotor und einem Platteneimer. Nach der Zentrifugation wird der Parafilm vorsichtig entfernt und die Platte drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Dann ersetzen Sie das Transfektionsmedium in jedem Brunnen vorsichtig durch zwei Milliliter vorwarmes vollständiges DMEM-Medium. Inkubieren Sie die transfektierten Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 48 Stunden und bewerten Sie die Transfektionseffizienz durch Bewertung der GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie. Seed HEK 293T leitete Zellen in zwei 6-Well-Platten ab, wie zuvor gezeigt.

Bestimmte eine Platte für die Erzeugung von SARS-CoV-2-Spike-Pseudoviren und die andere für VSVG-Pseudoviren. Am Tag des Experiments bereiten Sie die Transfektionsmischung und die PEI-DNA-Komplexe vor und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Während der Inkubation wird das Medium vorsichtig aus jeder der sechs Brunnenplatten entfernt, ohne die Zellmonoschicht zu stören.

Fügen Sie langsam einen Milliliter vorgewärmtes vollständiges Transfektionsmedium ohne Antibiotika zu jedem Brunnen hinzu, sodass das Medium die Wand des Brunnens hinunterlaufen kann. Fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexe den Zellen hinzu, um sie wie zuvor demonstriert zu transfektieren. Nach 48 Stunden Inkubation nach der Transfektion werden die Supernatanten aus jedem Brunnen in ein 50-Milliliter-steriles konisches Zentrifugenrohr gesammelt und bei 290 G sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Sammeln Sie den zellfreien Überbein und filtern Sie ihn durch eine sterile 0,45-Mikrometer-Polyvinylidenfluorid-Flaschenfilteranlage. Bereiten Sie einen Milliliter Aliquot des gefilterten Supernatanten vor und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius Samen 2,5 mal 10 auf die Leistung von vier HSI-Zellen, einer hochgradig SARS-CoV-2-anfälligen Zelllinie, in 50 Mikrolitern vollständigem DMEM pro Bohrloch in einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Bereite für jede zu testende Erkrankung dreifache Brunnen vor und markiere sie, einschließlich funkenloser Pseudovirusinfektion und nicht-infizierten Kontrollen.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Am Tag der Transduktion taut man einen Aliquot jeder Pseudoviruscharge auf Eis auf und mischt sanft durch Inversion, einschließlich eines Aliquot der spikeless Kontrolle. Füge die erforderlichen Mengen an Pseudovirusvorbereitung direkt zu den vorgesehenen Brunnen hinzu.

Stellen Sie das Volumen jedes Bohrlochs mit vollständigem DMEM auf 150 Mikroliter ein. Jetzt versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und zentrifugieren Sie bei 2.500 G für 45 Minuten bei Zimmertemperatur ohne Unterbrechung. Entfernen Sie die Parafilm-Versiegelung und brüten Sie die Platte 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid aus.

Nach der Inkubation bereiten Sie die Luciferase-Assay-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Taue das Luciferase-Substrat und den 5-fachen Luciferase-Lysepuffer bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten auf. Verdünne den 5-fachen Luciferase-Assay-Lysepuffer auf 1-fach mit sterilem Wasser.

Aspirieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie das Supernatant. Als Nächstes fügen Sie jedem Brunnen 30 Mikroliter 1-fachen Lysepuffer hinzu. Legen Sie den Teller auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie ihn 10 Minuten lang bei 150 Umdrehungen pro Minute bei Zimmertemperatur.

Überprüfen Sie die vollständige Zelllyse unter einem umgekehrten Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig lysiert und nicht unterscheidbar sind. Dann übertragen Sie die Lysate auf eine undurchsichtige weiße 96-Well-Platte. Gib jedem Brunnen 50 Mikroliter Luziferase-Substrat hinzu.

Mischen Sie kurz, indem Sie die Platte sanft in einer kreisenden Bewegung bewegen, und setzen Sie die Platte in das Luminometer ein, um die Lumineszenz zu messen. Seed 2,5 mal 10 in der Potenz von vier HSI-Zellen in 50 Mikrolitern vollständigem DMEM pro Bohrloch in einer zuvor beschriebenen 96-Bohrloch-Platte. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag bereiten Sie eine bis drei serielle Verdünnungen der zu testenden Verbindungen vor, wie Arbidol in vollständigem DMEM mit 0,5 % Dimethylsulfoxid. Mit einer Mehrkanalpipette aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus jedem Brunnen. Fügen Sie jedem Bohrloch 50 Mikroliter der entsprechenden Verbindungsverdünnung hinzu und fügen Sie den Kontrollbohrlöchern der Spalte 12 vollständiges DMEM hinzu.

Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Ohne die Verbindungen zu entfernen, fügen Sie direkt 50 Mikroliter SARS-CoV-2 Spike-Pseudovirus zu jedem Brunnen hinzu, der in einem vollständigen Medium mit denselben Verbindungskonzentrationen verdünnt wurde. Versiegeln Sie den Teller mit Parfilm.

Zentrifugiere bei 2.500 g für 45 Minuten bei Raumtemperatur ohne Unterbrechung. Nach dem Entfernen des Parfilms inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden. Quantifizieren Sie schließlich die Infektivität mit einem Luciferase-Test, wie zuvor gezeigt.

Die Transfektion von HEK 293T-abgeleiteten Zellen mit verzweigtem PEI führte zu einer hohen Transfektionseffizienz, was zu etwa 70 % GFP-positiven Zellen führte. 48 Stunden nach der Transfektion. Die Infektion anfälliger HSI-Zellen mit abnehmenden Mengen an SARS-CoV-2-Spike-Pseudoviren oder VSVG-Pseudoviren zeigte eine dosisabhängige Zunahme der Lumineszenz mit zunehmendem Pseudovirusinput.

Spitzenlose Pseudoviren und uninfizierte Zellen zeigten sehr geringe Lumineszenzwerte. Die Verbindung Arbidol wurde auf ihre Fähigkeit getestet, den Eintritt in Pseudoviralen zu hemmen, und sie erzeugte eine klare Dosis-Antwort-Hemmung der Luciferase-Aktivität, die von Spike-Pseudoviren erzeugt wird, wobei bei VSVG-Pseudoviren weniger Hemmung beobachtet wurde. Der Test zeigte einen Z-Primfaktor von 0,54, was auf die Eignung für Screening-Zwecke hinweist.

Die Behandlung mit Arbidol in Konzentrationen ab 30 Mikromolar beeinflusste die Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu den Zellen, die nur mit 0,5%-Dimethylsulfoxid-Vehikel behandelt wurden, nicht signifikant. Dieses Protokoll ermöglichte die Produktion von Hochtiter-Pseudoviren unter optimierten Bedingungen. Dies ermöglicht es Forschern, den Pseudoviraleintritt zu messen und Verbindungen zu identifizieren, die die durch SARS-CoV-2-Spike vermittelte Infektionen hemmen.

Eine hohe Transfektionseffizienz ist entscheidend, um Hochtiter-Pseudoviren zu erzeugen und zuverlässige Infektionssignale in nachgelagerten Assays zu erhalten. Dieses System unterstützt ein Hochdurchsatz antivirales Screening und die Abwertung von Eintrittsinhibitoren gegen aufkommende SARS-CoV-2-Varianten und kann leicht angepasst werden, um Pseudoviren zu erzeugen, die Hüllproteine anderer Viren zeigen.