Genomweite Kartierung von Histonmodifikationen und Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren in neuroendokrinen kleinzelligen Lungenkrebszelllinien mittels CUT&RUN

Das Ziel unserer Forschung ist es also, die Wechselwirkungen zwischen lineal-definierenden Transkriptionsfaktoren und chromatin-remodellierenden Proteinen in den verschiedenen Typen von kleinzelligem Lungenkrebs zu identifizieren, bei der Regulierung der Transkriptionslandschaften und wie diese Interaktionen zu Krankheitsprozessen beitragen können, einschließlich Krebsinitiation und -progression. Wir wollen dies erreichen, indem wir Experimente wie CUT&RUN durchführen, eine Next-Gen-Sequenzierungstechnik, die weltweit die genomischen Standorte dieser unterschiedlich modifizierten Histone und DNA-gebundenen Transkriptionsfaktoren profilieren oder identifizieren kann. Letztlich hoffen wir, neue Signalwege zu identifizieren, die epigenetisch reguliert sind und therapeutisch für die Entwicklung neuer Behandlungen für Patienten mit dieser sehr aggressiven Form von Lungenkrebs geeignet sein könnten.

Zu Beginn entnehmen Sie die kultivierten neuroendokrinen Lungenkrebs aus dem 37-Grad-Inkubator und untersuchen sie unter dem Mikroskop, um ihre Qualität sicherzustellen. Dann wird die Zellsuspension in ein 50-Milliliter-konisches Rohr übertragen und das Rohr bei 1.200 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie das Medium aus dem konischen Rohr mit dem Vakuum in der Haube ab und spülen Sie das resultierende Zellpellet mit 20 Millilitern PBS.

Zentrifugiere das Rohr erneut bei 1.200 g für fünf Minuten und aspiriere das PBS. Fügen Sie Accutase je nach Pelletgröße hinzu und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um das Zellpellet zu verdauen. Als Nächstes beenden Sie die Verdauung, indem Sie fünf Milliliter PBS mit 10 % FBS hinzufügen und mischen, um eine einzellige Suspension zu erhalten.

Nach erneuter Zentrifugierung der Zellen, wie zuvor gezeigt, wird das Pellet in fünf Millilitern PBS neu suspendiert. Zählen Sie die Startzellen und bestätigen Sie ihre Lebensfähigkeit und Integrität mit dem automatischen Zellzähler. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen und addieren Sie 20 % Überschuss, um Pipettierungsfehler zu berücksichtigen.

Übertragen Sie die berechnete Gesamtzahl der Zellen auf 1,5-Milliliter-Röhren und zentrifugieren Sie die Röhren bei Raumtemperatur für drei Minuten bei 600 g. Die Zellen werden im Waschpuffer mit einer Dichte von fünf mal zehn pro Reaktion mit einer Potenz von fünf Zellen pro Reaktion wieder suspendiert, insgesamt sechs Reaktionen. Verwenden Sie pro Reaktion 100 Mikroliter Puffer und pipettieren Sie vorsichtig, aber gründlich, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten.

Zentrifugiere die Zellen erneut, entferne das Supernatant und wiederhole das Waschen. Aliquot 100 Mikroliter der gewaschenen Zellen in jede Röhre eines Acht-Streifen-Sets, das 10 Mikroliter aktivierte Concanavalin-A-Perlen enthält. Sanft pipetten, um den Inhalt zu vermischen.

Inkubieren Sie die Perlenzell-Schlamm 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Zelle an die Perlen bindet, und drehen Sie die Röhren schnell in einer Mini-Zentrifuge, um die Schlamm aufzufangen, ohne dass die Perlen absinken. Setze die Schläuche auf ein 0,2-Milliliter-Magnetrack für Röhren. Lassen Sie den Slurry klar werden und pipetten, um das Supernatant zu entfernen.

Dann entferne ich die Schläuche vom Magneten. Fügen Sie jeder Reaktion sofort 50 Mikroliter eiskalten Antikörperpuffer hinzu und pipieren Sie die Perlen vorsichtig, um sie wieder zu suspendieren. Beschrifte die acht Streifenröhrchen entsprechend.

Fügen Sie jeweils 0,5 Mikrogramm H3K4me3, H3K4me1 und Immunglobulin-G-Antikörper sowie 0,6 Mikrogramm E2F7 polyklonalen Antikörper aus verschiedenen Quellen zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu. Pipette den Inhalt jedes Reaktionsröhrchens vorsichtig und brüte sie über Nacht auf einem Nutator bei vier Grad Celsius mit erhöhten Röhrenkappen. Entferne die acht Streifenröhrchen aus dem Nutator und führe eine schnelle Drehung durch, um Flüssigkeit am Boden jedes Rohrs aufzufangen.

Stelle jetzt die Röhren auf den Magnethalter, bis der Slamry frei ist. Dann pipettiert man vorsichtig, um das Überdeckmittel zu entfernen und zu entsorgen. Lassen Sie die Röhren auf dem Magnetstand stehen, waschen Sie jedes Rohr zweimal mit 200 Mikrolitern kaltzelliger Permeabilisierungspuffer und verwenden Sie nach jeder Wasche eine Mehrkanalpipette, um das Supernatant zu entfernen.

Als Nächstes entferne ich die Schläuche vom Magnethalter. Fügen Sie jeder Reaktion sofort 50 Mikroliter kaltzellendurchlässiger Puffer hinzu und pipieren Sie vorsichtig, um die Zellen und Perlen wieder aufzuhängen. Dann fügen Sie jeder Reaktion 2,5 Mikroliter Protein AG-Mikrokokkalnuklease hinzu und mischen Sie sich gut durch sanftes Pipetten.

Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur führen Sie eine schnelle Drehung der Röhrchen durch. Legen Sie sie zurück auf den Magnethalter, bis der Schlamm frei ist, und entfernen Sie dann das Supernatant. Nach zweimaligem Waschen der Perlen mit einem Kaltzell-Permeabilisierungspuffer werden sie vorsichtig in 50 Mikrolitern des zelldurchlässigen Puffers wieder suspendiert.

Während Sie die Röhren auf Eis lassen, fügen Sie jeder Reaktion im achtröhrigen Streifen des vorherigen Schritts einen Mikroliter 100 millimolaren Calciumchlorid hinzu. Pipette sanft, um die Perlen vollständig wieder aufzuhängen und eine effiziente Verdauung zu fördern. Inkubieren Sie die Röhren auf einem Nutator bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, wobei die Röhrenkappen während der gesamten Inkubation erhöht bleiben.

Jetzt in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen bereiten Sie die Stop-Puffer-Mischung vor, indem Sie 33 Mikroliter Stop-Puffer mit einem Mikroliter Escherichia-coli-Spike in DNA von 0,5 Nanogramm pro Reaktion kombinieren. Vorsichtig vortoxen, um die Lösung zu mischen. Am Ende der zweistündigen Inkubation geben Sie 33 Mikroliter des vorbereiteten Stoppuffer-Gemisch zu jedem Reaktionsrohr und mischen Sie gründlich.

Inkubieren Sie die Reaktionsröhren in einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach einer kurzen Drehung stellen Sie die Röhren auf ein Magnetgestell, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie vorsichtig etwa 85 Mikroliter des Supernatants mit der CUT&RUN-Freigabe-DNA in frische 1,5-Milliliter-Röhren.

Reinigen Sie die gewonnene DNA, bewerten Sie deren Menge und führen Sie eine Fragmentgrößenverteilung zur Qualitätskontrolle durch. Anschließend wird mit der CUT&RUN-Bibliotheksvorbereitung, Quantifizierung, Indexed Library Pooling und Paired-End-Next-Generation-Sequenzierung fortgesetzt. Achaete-scute homolog-1 hohe Zelllinien, DMS79 und H146 sowie Neurogenic Differentiation Factor 1 High Celllines wuchs H82 als nicht-adhärente Aggregate oder kompakte Sphäroide in Suspension, während H446 eine gemischte Morphologie aufwies, mit etwa 80 % inhärenten Zellen und 20 % in Suspension.

Die Analyse von CUT&RUN-DNA-Fragmenten ergab, dass das Histon-Sternzeichen H3K4me1 die höchsten DNA-Mengen in allen Zelllinien lieferte, gefolgt von H3K4me3, während E2F7 und IgG die niedrigsten Mengen ergaben. Für extrahierte CUT&RUN-DNA zeigte die Fragmentgrößenverteilung für H3K4me1 und H3K4me3 deutliche Spitzen für Mononukleosom und Dinukleosom sowie genomische DNA. Im Gegensatz dazu wurden keine deutlichen Spitzen für E2F7 oder die IgG-Kontrolle festgestellt.

Trotz geringer DNA-Eingabe wurden für alle CUT&RUN-Ziele, einschließlich E2F7 und IgG, erfolgreich Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation erstellt. Die Heatmap-Analyse in DMS79-Wildtyp- und H146-heterozygoten mutanten Zellen zeigte, dass H3K4me3- und E2F7-Signale in der Nähe der Transkriptionsstartstellen angereichert waren, während H3K4me1-Signale breiter verteilt waren. Die Genom-Browser-Visualisierung in einer zufällig ausgewählten Chromatinregion zeigte deutliche Spitzen für H3K4me3, H3K4me1 und E2F7, während IgG keine Anreicherung zeigte.

Traditionell haben Wissenschaftler und Forscher Chromatin-Immunfällung gefolgt von Sequenzierung oder ChIP-Seq verwendet, um Fragen wie die von uns gestellten Fragen zu beantworten. Allerdings benötigt ChIP-seq eine recht hohe Menge an Eingabematerialien, was je nach verwendetem Modell nicht immer machbar ist. CUT&RUN hingegen benötigt deutlich weniger Eingabematerial, so wenig wie 50.000 Zellen, und erfordert weniger hochdurchsatz-Sequenzierungslesungen, was bedeutet, dass es kostengünstiger ist und deutlich weniger Hintergrundinformationen bei der Datengenerierung liefert.

CUT&RUN ist eine Technik, die nicht nur auf Zellen in 2D-Kulturen angewendet werden kann, sondern auch für andere präklinische Modelle wie patientenabgeleitete Organoide und Xenotransplantate angepasst werden kann. Es kann auch verwendet werden, um die Chromatinlandschaft in Geweben zu profilieren, einschließlich normaler und kranker Gewebe. Das ist also eine unglaublich nützliche Technologie oder Technik für Krebsforscher, kann aber auch für Nicht-Krebsforscher, die sich auf die Erforschung verschiedener menschlicher Krankheiten konzentrieren, sehr nützlich sein.

Dieses Protokoll ermöglicht eine Kartierung von Histonmodifikationen und den erhaltenen Profilen der verschiedenen Proteine in situ im zellulären Genom. Die Bereitstellung von Histon-PTMs und der TF-Bindung über SCLC-Subtypen hinweg kann subtypspezifische, zielberechtigte Gene und regulatorische Elemente wie Enhancer und Super-Enhancern offenbaren.