Validierung des hyperbaren Drucksystems mit Xenon-Anästhesie für Drosophila melanogaster

Meine Forschung zielt darauf ab, zu verstehen, wie Vollnarkose funktioniert, und es gibt mehrere Gase, die unter hyperbaren Bedingungen anästhetisch wirken. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Fruchtfliegen mit Xenon zu betäuben, um den Grundmechanismus der Vollnarkose zu untersuchen. Zu Beginn sammeln Sie 20 betäubte weibliche und männliche Drosophila melanogaster-Fliegen, die ein bis drei Tage alt sind, für jedes Experiment und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden vor dem Experiment in einem Fläschchen mit Nahrung bei etwa 22 Grad Celsius ruhen.

Die Gase aus den Gasflaschen des Behälters werden in undichte Gasbeutel für den experimentellen Einsatz übertragen. Mit Silikonrohren werden die Gasflaschenauslassöffnungen direkt mit dem Gasbeuteleinlass verbunden, um den Gastransport zu ermöglichen. Befestigen Sie einen 25 Millimeter langen Silikonschlauch an eine Polypropylenspritze.

Verbinden Sie die Polypropylenspritze mit den Gasbeuteln und dem Dreifach-Tap. Um das hyperbare Setup zusammenzubauen, positionieren Sie zunächst den LED-Leuchttisch im Querformat auf dem Tisch. Stellen Sie die Einspritzpumpe neben eine kurze Seite des LED-Leuchttischs, so ausgerichtet, dass die experimentelle Spritze, wenn sie platziert ist, über die Hintergrundbeleuchtung hinausragt.

Schneiden Sie jetzt ein 75 Millimeter langes Silikonrohr. Verbinden Sie den Drei-Wege-Hahn mit dem Manometer über das Silikonrohr von der zentralen Düse. Verwenden Sie Host-Federklammern an der Düse auf der Manometerseite und den Dreifach-Tapp oben auf der Seite, um sicherzustellen, dass das Rohr fest befestigt ist.

Dann verwenden Sie die mit einem Doppelpfeil an der Einspritzpumpensteuerung markierte Taste, um die Geschwindigkeit auf 80 Millimeter pro Minute und die Dauer auf 38 Sekunden für automatische Kompression oder Dekompression des Kolbens einzustellen. Als Nächstes begrenzen Sie das Umgebungslicht im Experimentierraum und schalten Sie den LED-Leuchttisches ein. Stelle die Helligkeit auf drei, um den Videokontrast zu erhöhen.

Nehmen Sie den Pümpel aus der Polycarbonatspritze. Führe eine kleine Menge Baumwolle in die Spritzenspitze, um das Ausweichen der Fliege zu verhindern. Um 40 Fliegen in die Polycarbonat-Spritze zu übertragen, nehmen Sie den Fläschchendeckel ab, legen Sie den Spritzenbehälter auf das Fläschchen, wenden Sie die Baugruppe um und tippen Sie an, um die Fliegen in den Spritzenbehälter zu bewegen.

Richte die Spritze so aus, dass die Laufmarkierungen zur Kamera zeigen, um die Fliegen optimal zu visualisieren. Sichern Sie die Spritze, indem Sie sowohl den Lauf als auch den Kolbenkopf mit den verstellbaren Schrauben an der Einspritzpumpe befestigen. Jetzt entferne die Baumwolle von der Spritzenspitze und verbinde die Spritze mit dem Dreifach-Tap.

Fang mit der Videoaufnahme an. Schalten Sie das Manometer ein, dann drehen Sie den Stopp, um das Manometer mit der Spritze zu verbinden und den Null-Kilopascal-Druck zu bestätigen. Wenden Sie den Drei-Wege-Tap auf die seitliche Position, um den Luftaustausch mit der Spritze zu ermöglichen.

Mit der manuellen Steuerung der Einspritzpumpe bewegt man den Kolben von der 20-Milliliter-Marke auf die 2-Milliliter-Marke. Aspirieren Sie 18 Milliliter Narkosegas aus dem Gasbeutel in die Polypropylenspritze. Verbinden Sie die Spritze mit dem seitlichen Lockverschluss des Dreifach-Zapfs.

Dann nutzt man die manuelle Option der Einspritzpumpe, um den Kolben wieder auf die 20-Milliliter-Marke zu bringen. Drehen Sie den Stopp, um das Manometer mit der Spritze zu verbinden, und beobachten Sie die Druckanzeige. Starte die automatische Plunger-Bewegung mit den voreingestellten Geschwindigkeits- und Dauereinstellungen.

Lassen Sie den Kolben innerhalb von 38 Sekunden die fünf Milliliter erreichen, während Sie den Druck überwachen. Lass den Kolben 20 Sekunden auf der Fünf-Milliliter-Position stehen und achte auf den Spitzendruck. Tippen Sie sanft auf die Spritze, um die am Pümpel haftenden Fliegen zu lösen, und lassen Sie sie unten absinken.

Starte die automatische Dekompression nach 20 Sekunden. Beende das Experiment, sobald der Kolben wieder 20 Milliliter erreicht hat, und nimm den Enddruck zur Leckkontrolle auf. Starte ScreenFlow, um die Videos zu bearbeiten.

Schneiden Sie jedes aufgenommene Video auf die interessante Region zu, die den ersten fünf Millilitern des Spritzenlaufs entspricht. Kürze jedes Video auf die ersten 20 Sekunden nach der Dekompression der Spritze. Exportiere die Videos als GIFs und dupliziere sie.

Starte jetzt die Fiji-Software, um die ersten und letzten Frames von verschiedenen Duplikaten zu entfernen. Klicke nacheinander auf Bild, Videobearbeitung und lösche die Frames. Klicken Sie auf Prozess, Binär, und machen Sie Binärdateien zu jeder GIF-Datei binär, sodass Fliegen auf schwarzem Hintergrund weiß erscheinen.

Öffnen Sie beide Binärdateien in Fiji. Berechnen Sie den Pixelunterschied zwischen ihnen, indem Sie Prozess und Bildrechner auswählen, um eine Pixeldifferenzdatei zu erstellen. Nach dem Speichern der Pixeldifferenzdatei wählen Sie Teilchen analysieren und analysieren und passen die Pixelgrößenschwellenwerte an, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern.

Speichere die generierte CSV-Datei mit Pixelunterschieden pro Frame. Verwenden Sie die Daten, um die kumulative Bewegung über die Frames hinweg für statistische Vergleiche zu berechnen. Die experimentellen Videos wurden verarbeitet, indem sie in Binär- und Differenzbilder umgewandelt wurden, um die Pixelanalyse vorzubereiten.

Ohne Schwellenwert sammelten sich Pixelunterschiede über Frames an und erhöhten das Basissignal auf etwa 20.000. Das Anbringen einer Pixelgrößenschwelle von 100 bis 1000 reduzierte das Hintergrundsignal und betonte Unterschiede, die durch Fliegenbewegungen verursacht wurden. Pixelunterschiedswerte pro Bild blieben vor Bild 200 nahezu null.

Das YOLOv11 N-Modell verfolgte Fliegen mit hoher Genauigkeit pro Bild, aber häufige Verschlüsse führten zu übermäßigen Fliegen-ID-Zuweisungen. Aufgrund von Tracking-Inkonsistenzen wurde die Flugbewegung quantifiziert, indem alle ID-Bewegungen pro Experiment zusammengezählt und maximal 200 IDs normalisiert wurden. Fliegen, die 85 % Xenon ausgesetzt waren, erholten sich schneller und bewegten sich mehr als jene, die 90 % oder 95 % Xenon ausgesetzt waren.

Unser Protokoll bietet Einfachheit und Geschwindigkeit und verwendet günstigere Materialien als herkömmliche Druckkammern. Der maximale Druck ist auf etwa vier Atmosphären begrenzt, und eine unvollkommene Abdichtung führt zu einem allmählichen Druckverlust. Dieses Setup ermöglicht reproduzierbare Messungen der Wirkung von Anästhesiegasen auf das Verhalten kleiner Modellorganismen.