Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel

Die medizinische Blutegel ist aufgrund ihrer Einfachheit, Zugänglichkeit und der Möglichkeit, identifizierte Neuronen mit zahlreichen experimentellen Methoden von der frühen Embryogenese bis ins hohe Alter zu untersuchen, ein nützliches Modellsystem für neurobiologische Studien. Eine besonders spannende Anwendung des embryonalen Blutegels besteht in Zeitrafferaufnahmen zur Untersuchung des neuronalen Wachstums im lebenden, intakten Tier, nach sehr präzisen Modifikationen der Genexpression im zu untersuchenden Neuron oder dessen Zielstrukturen. In diesem Video stellen wir eine neuartige Technologie zur schnellen, genauen und hochlokalisierten Applikation von Reagenzien in innere Schichten lebender Blutegel-Embryonen vor, die mittels einer pneumatischen Kapillarpistole erfolgt, die in Zusammenarbeit zwischen dem Labor von Alex Grossman und unserem Labor entwickelt wurde.

Obwohl diese Technik für die Abgabe von doppelsträngiger DNA-RNA oder jedes anderen Moleküls, das auf mikroskopische Goldpartikel aufgebracht werden kann, verwendet werden kann, werden wir sie sowohl für den Knockdown als auch für den Knockin des Axonleitungs-Moleküls Rin nutzen. Hallo, ich komme aus dem Labor von Eduardo Ano in der Abteilung für Biowissenschaften an der University of California San Diego. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Herabregulierung oder Einführung der Expression des Axonleitungs-Moleküls Networking zeigen, das natürlicherweise in der ventralen Körperwand, jedoch nicht in der dorsalen Region aller Körpersegmente der Lech exprimiert wird.

Wir werden Moleküle doppelsträngiger RNA oder Plasmid-DNA in die Körperwand und die Ganglien ausgewählter Segmente in frühen Entwicklungsstadien einführen. Die ganzheitliche Applikation mittels pneumatischer Kapillarpistole ist besonders wichtig, da sie es ermöglicht, die Muster der Genexpression in ausgewählten Bereichen eines Subsegments zu stören, wobei die unbehandelten Segmente als interne Kontrolle dienen. Darüber hinaus kann sie genutzt werden, um in frühen Entwicklungsstadien die inneren Zellschichten zu erreichen, ohne das Gewebe zu beschädigen oder das Präparat zu öffnen.

Zuletzt bietet die ganzheitliche Applikation den Vorteil, eine begrenzte Anzahl von Zellen an einem ausgewählten Ort gezielt anzusteuern, was zwischen dem Einzelzell-Knockdown mittels Mikroinjektion und dem systemischen Knockdown durch genetische Ansätze liegt. Beginnen wir also. Das medizinische LE wird seit langem verwendet, um die Eigenschaften von Nervenzellen und verhaltensbezogenen neurologischen Schaltkreisen zu untersuchen, aufgrund der Einfachheit des zentralen Nervensystems, das etwa 200 bilaterale Neuronenpaare und eine kleine Anzahl riesiger Gliazellen umfasst.

Jedes segmentale Ganglion der 21 Körpelsegmente sowie jedes einzelne Neuron der Blutegel lässt sich vom frühen Embryo bis zum ausgewachsenen Tier von Exemplar zu Exemplar wiederholt identifizieren und untersuchen. Bereits seit der Zeit der Pharaonen wird der Blutegel zur Aderlassbehandlung verwendet, und seine anhaltende Anwendung in der Medizin macht ihn leicht über kommerzielle Tierlieferanten verfügbar. Da wir jedoch die Entwicklung des Nervensystems untersuchen, unterhalten wir in unserem Labor eine lebende Kolonie mit mehreren hundert Blutegeln, die uns kontinuierlich mit Embryonen für unsere Experimente versorgt.

Blutegel sind Hermaphroditen. Sie besitzen sowohl weibliche als auch männliche Strukturen und befruchten sich gegenseitig. Daher können alle Exemplare Eier legen.

Sie tun dies in eine Struktur namens Kokon, die sie selbst mithilfe einer Reihe spezieller Drüsen herstellen, welche sehr interessante Polymere in einem Körperabschnitt namens C clay tellum ausscheiden. Eine Blutegel, die bereit ist, Eier abzulegen, gräbt sich in Moos ein, das wir in Behältern bereitstellen, und beginnt, diesen eiförmigen Kokon um ihren Körper zu bilden. Sobald genügend Material ausgeschieden wurde und die Moleküle mit der Polymerisation begonnen haben, legt der Blutegel Eier sowie eine nahrhafte Dottersubstanz im Inneren des Kokons ab und windet sich dann heraus. Mithilfe einer Rasierklinge können wir die Embryonen entnehmen, indem wir an einem Ende des Kokons ein Fenster aufschneiden.

Im Allgemeinen enthält jeder Kokon ab dem sechsten Tag nach Beginn der Differenzierung etwa 10 bis 20 Embryonen. Die Embryonen können aus dem Kokon entnommen und in Teichwasser kultiviert werden. In diesen Entwicklungsstadien beginnen wir gewöhnlich unsere experimentellen Untersuchungen zur neuronalen Entwicklung.

Der erste wichtige Schritt dieses Verfahrens ist die Herstellung beschichteter Partikel. In dieser Demonstration zeigen wir, wie man Goldpartikel, die mit doppelsträngigen RNA-Molekülen des Lech-Homologs des Axonleitungsproteins Rin beschichtet sind, in Lech-Embryonen einführt. Die Zielzellen sind ventrale Längsmuskeln der Körperwand, von denen bekannt ist, dass sie Rin ab frühen Stadien der Agenesis exprimieren und freisetzen.

Unser Ziel ist es, die natürliche Expression in einem einzelnen Körperrsegment so früh wie möglich während der Entwicklung zu unterdrücken und zu beobachten, wie sich dies auf die Kategorisierung von Neuronen auswirkt, die auf diesen wichtigen Entwicklungs­faktor empfindlich reagieren. Für diesen Schritt werden ein Ultraschallbad, ein Vortex, eine Tischzentrifuge und ein Eisbehälter benötigt. Außerdem wird 100 % Isopropanol benötigt, das vor der Verwendung auf Eis gestellt werden sollte.

Beginnen Sie mit 100 Mikroliter Bindungspuffer, der 50 Milligramm Vault-Partikel pro Milliliter enthält. Diese Partikel sind für die RNAi konzipiert und werden von der Firma chell hergestellt. Verdünnen Sie anschließend die Partikellösung, indem Sie 100 Mikroliter Bindungspuffer hinzufügen, kurz vortexen und eine bis zwei Minuten sonizieren, um Partikel zu trennen, die möglicherweise zusammengeklumpt sind.

Nach der zweiminütigen Syndikation fügen Sie fünf bis 10 Mikrogramm doppelsträngige RNA zu den Partikeln hinzu, wirbeln Sie kurz an und lassen Sie sie zwei Minuten bei Raumtemperatur stehen. Sobald die zwei Minuten verstrichen sind, zentrifugieren Sie die Komplexe aus doppelsträngiger RNA und Partikeln mindestens 15 Sekunden lang mit 2.500 U/min im Mikrozentrifugens.

Um das Pellet zu erhalten, entfernen Sie die Überstände und geben 750 µL Isopropanol hinzu, wobei das Pellet möglichst wenig gestört wird. Kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren und nach der Zentrifugation die Überstände entfernen. Suspendieren Sie die Goldpartikel anschließend in 100 % kaltem Isopropanol durch Beschallung. Geben Sie kurzzeitig zwei bis drei Impulse im besten Fall mittels Beschallung ab, um die Partikel zu dispergieren.

Geben Sie die Probe auf einen Objektträger und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig verdunsten. Die besten Ergebnisse erzielt man, wenn die Partikel unmittelbar vor ihrer Applikation auf das Gewebe beschichtet werden, was wir Ihnen im nächsten Schritt zeigen werden. Bevor Sie die in-situ-Transfektion durchführen, werfen wir nun einen Blick auf den experimentellen Aufbau und dessen Vorbereitung.

Die pneumatische Kapillarpistole ist an einem Mikromanipulator befestigt, um eine genaue Abgabe von Partikeln in die Embryonen zu ermöglichen. Die Oberfläche des Embryos wird mit einem Videomikroskop abgebildet. Ein Halbleiterlaser erzeugt einen Lichtstrahl, der durch die innere Kapillare der Pistole geleitet und zur Zielerfassung im Zielgewebe verwendet wird.

Getrennte Leitungen aus Titan-Schläuchen, die mit den drei Zuführöffnungen des Pistolenkopfes verbunden sind, leiten druckluftunterstütztes Heliumgas aus einer einzigen Quelle. Eine Leitung ist stets geöffnet und erzeugt einen kontinuierlichen Heliumgasstrom durch die Pistole. Zwei weitere Leitungen sind normalerweise mit einem Magnetventil verschlossen und enthalten Goldpartikel mit zwei unterschiedlichen Beschichtungen, die zuvor in die Schläuche eingefüllt wurden.

Als trockenes Pulver. Die äußere Kapillare der Pistole ist mit einem Vakuumsystem verbunden, das einen Relativdruck von minus 12,5 PSI aufweist. Der Gegendruck von hi wird zwischen 10 und 15 PSI variiert, um die gewünschte Partikeleindringtiefe einzustellen.

Der Heliumkopfdruck kann die Eindringtiefe der Partikel stark beeinflussen, ebenso wie der Abstand des Embryos zur Waffe. Der Düsendurchmesser, der je nach Genkanone variiert, ist wichtig und sollte entsprechend dem Zielbereich gewählt werden. Nachdem wir nun unseren Versuchsaufbau gezeigt haben, laden wir unsere Jing-Kanone und beschießen einige Lech-Embryonen.

Bevor das Titanrohr geladen wird, ist es entscheidend, dass die beschichteten Goldpartikel vollständig trocken sind. Die beschichteten Goldpartikel werden zunächst mit einem Deckglas oder einem Rasiermesser von den Objektträgern abgekratzt und sind dann bereit, in das gefaltete Stück Waffelpapier geladen zu werden. Das Rohr sollte nahe dem Verbinder zu einer U-Form gebogen werden, damit sich die Partikel beim Befüllen nicht entlang des gesamten Rohrs verteilen, sondern sich nahe dem Verbinder konzentrieren.

Nehmen Sie die Partikel mit einem kleinen Spatel oder einem V-förmigen Stück Wägepapier auf und füllen Sie sie in die Kapillare ein. Klopfen Sie während des Befüllens mit dem Finger auf die Kapillare, um die Partikel gleichmäßig zu verteilen. Nachdem die Kapillare befüllt ist, können wir nun mit der Applikation der doppelsträngigen RNA mittels Jing-Pistole fortfahren, jedoch erst, nachdem wir unsere Blutegel vorbereitet haben.

Hier sehen Sie unsere etwa 10 Tage alten Blutegel-Embryonen. Sie befinden sich nun in einem sterilen Medium, in dem sie sowohl vor als auch nach der Applikation von doppelsträngiger RNA aufbewahrt werden. Der erste Schritt bei der Vorbereitung der experimentellen Embryonen für die Zufuhr von doppelsträngiger RNA besteht darin, eine Lösung mit 8 % Ethanol in steriles Medium auf ein flaches Stück flexiblen Silikons mit einer V-förmigen Nut zu geben.

Ein Embryo wird hinzugefügt und unmittelbar vor dem Beschuss mit Partikeln mit der Bauchseite nach oben platziert. Das Medium in der Kammer wird bis knapp unter die obere Oberfläche des Embryos abgesenkt, und ein Stück Filterpapier mit einem kleinen Loch in der Mitte wird daraufgelegt, um den Embryo zu stabilisieren und zu verhindern, dass seine Oberfläche austrocknet, gleichzeitig aber nur den Bereich freizulegen, der in dem embryonalen Stadium, das wir heute verwenden, gezielt behandelt werden soll. Im Stadium E 10 befinden sich die Längsmuskelzellen etwa 10 bis 20 Mikrometer unterhalb der äußeren Oberfläche, innerhalb der Epidermis, der Dermis und der Ringmuskulatur.

Im Gegensatz zu den Muskelzellen liegen die zentralen Ganglien an der ventralen Seite der Embryonen in den embryonalen Entwicklungsstadien, mit denen wir arbeiten (E sieben bis E 12), etwa 50 Mikrometer unterhalb der ventralen Körperoberfläche. Wir werden den Heliumdruck so einstellen, dass wir die Längsmuskeln anvisieren, die in geringerer Tiefe liegen als die Ganglien. Nun sind wir bereit, die Längsmuskeln mit Goldpartikeln zu beschießen.

Eine Goldpartikelladung mit einem Gewicht von etwa einem halben Milligramm kann typischerweise für bis zu 10 Schüsse verwendet werden, wobei jeder einzelne Schuss gewöhnlich einige hundert Partikel liefert. Ein Schuss wird erzeugt, indem eines der Ventile kurz für 0,3 Sekunden geöffnet wird, wodurch ein Bolus von Partikeln aus der entsprechenden Schlauchleitung in die Waffe geleitet wird. Um den gewünschten Gewebebereich vollständig abzudecken, sind oft mehrere Schüsse erforderlich.

Das Rohr wird zwischen den Schüssen vorsichtig angeklopft, um einige Partikel zu lösen und deren Einspritzung in den kontinuierlichen Heliumstrom in der Waffenhülse zu erleichtern. Wenn ein zweiter Reagenz im selben Assay zugegeben werden soll, können alternative Partikel unmittelbar nach der Applikation der Goldpartikel in ein zweites Rohr geladen werden. Die Embryonen werden zurück in künstliches Teichwasser gegeben, vorzugsweise ein Embryo pro Schale, und dort ein bis drei Tage lang belassen, bis die RNAi- oder die ektopische Expression als ausreichend erachtet wird.

Während dieser Zeit werden die Embryonen bei Raumtemperatur in einer abgedunkelten Kammer aufbewahrt. Hier sehen Sie eine ceto-Hybridisierungsanalyse für narine, Mr.NA-Genabschaltung. Sie können erkennen, dass in dem behandelten Embryo nur wenige Muskelzellen terrin nicht exprimieren.

Diese Muskeln enthalten Partikel. Sie können sehen, dass, wenn die Partikel mit terrin-spezifischer doppelsträngiger RNA beschichtet wurden, eine deutlich sichtbare Herabregulation der Nardin-Expression verursacht wird, die nur in Zellen mit Partikeln auftritt, gewöhnlich ein bis zwei Partikel pro Zelle. Wenn Sie die Partikel mit einem Plasmid, das GFP kodiert, beladen, erhalten Sie Fluoreszenz in neuronalen Zellen, wenn sie mit der pneumatischen Kapillarpistole, die wir verwenden, in ihren Kernen stoppen.

In dieser Demonstration konnten wir beide Partikel in Zellen eines kleinen, lokalisierten Bereichs eines lebenden Embryos einführen, ohne nachweisbaren Schaden an den Zellen des Zielgebiets zu verursachen. Wir haben Ihnen außerdem gezeigt, wie die mobile Kapillarpistole der Technik der ganzheitlichen Abgabe neue Möglichkeiten verleiht, Gene in einem mikroskopisch kleinen, dreidimensional begrenzten und hochpräzise gezielten Gewebebereich gezielt zu aktivieren oder zu unterdrücken, ohne das Gewebe nachweislich zu schädigen. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.