Mikrobielle DNA-Analyse im Feld mit einem biologischen Extraktions-Feldkit und einer Feld-qPCR-Einheit

Der Umfang unserer Forschung besteht hauptsächlich darin, molekulare Analysen durchzuführen, mit denen wir Mikroben charakterisieren können, die an Sanierung, Bergbau, Korrosionsprävention beteiligt sind, und das hilft uns wirklich, Fragen zur Nachhaltigkeit zu beantworten. Diese Forschung adressiert eine Reihe von Forschungs- und Zugänglichkeitslücken durch den Einsatz zuverlässiger und praxisnaher molekularbiologischer Workflows, die einfach zu bedienen sind. Entdecke beide Enden des Filters und schließe eine mit Luft gefüllte Drei-Milliliter-Spritze über die Locker-Luer-Verbindung an den Filter an.

Drücken Sie die Luft durch, um das Restwasser auszustoßen. Trenne die Spritze und ziehe mehr Luft ein, bevor du das wiederholst. Dann den roten Steckdosendeckel wieder aufdecken.

Drehen Sie die Lösung um, eine Spritze zum Mischen. Entfernen Sie den Luer-Verriegelungs-Spritzendeckel und verbinden Sie die Lösung A-Spritze über die Luer-Verriegelungsspitze mit dem verkapselten 0,2-Mikrometer-Filtereinlauf. Drücken Sie den Pümpel herunter, um die Lösung A langsam hinzuzufügen. Dann schütteln Sie den geschlossenen Filter fünf Minuten lang kräftig von Hand.

Nun kann man die Spritze von Lösung B mehrmals umkehren, um zu mischen. Entfernen Sie die Luer-Verriegelkappe und verbinden Sie die Spritze über die Luer-Verriegelspitze mit dem gekapselten Filtereinlass. Nachdem Sie den Einlassfilterdeckel wieder aufgezogen haben, schütteln Sie den geschlossenen Filter fünf Minuten lang kräftig von Hand.

Entferne die Einlasskappe und drehe den Filter um. Verwenden Sie eine drei-Milliliter-Spritze, die an der gekapselten Filtereinheit befestigt ist, um einen Milliliter Luft in den Filter zu pumpen. Dann ziehe am Pümpel zurück, um das gesamte Lysat zu entfernen.

Transferiere das Lysat in ein fünf-Milliliter-Perlenrohr. Nachdem Sie sie mit Parafilm versiegelt haben, schütteln Sie das Perlenrohr fünf Minuten lang kräftig von Hand, bevor Sie es aufrichten. Legen Sie die Proben-Prep-Kartusche auf eine ebene Oberfläche und befestigen Sie eine Luer-Schließsäule an einer Ein-Milliliter-Spritze.

Verwenden Sie die spitze Spitze der Säule, um zwei Löcher in den ersten Abschnitt der Probenvorbereitungskatusche zu stechen. Pipettiere einen Milliliter Lysat aus dem Perlenrohr in das neu gestanzte Loch im ersten Abschnitt der Patrone. Setzen Sie die Spritzensäule wieder in den roten Bereich der Patrone ein.

Dann zieht man die Flüssigkeit vollständig in die Spritze und drückt sie dann zehnmal heraus. Positioniere nun die spitze Spitze der Spritzensäule über dem rot-orangen Abschnitt und stach zwei Löcher durch die Folienbarriere. Mit dem Kolben zieht man das gesamte Flüssigkeitsvolumen der Spritze ganz nach oben in die Spritze und pumpt die Flüssigkeit vollständig wieder heraus.

Ebenso verwenden Sie die Spritzensäule, um die orange, gelben, blauen, lufttrocknenden und grünen Abschnitte zu durchbohren und zu pumpen, wobei der Kolben so oft gezogen und gedrückt wird, wie auf dem Abschnitt angegeben ist. Anschließend wird mit der Ein-Milliliter-Spritze und der Probenzubereitungssäule die gesamte Lösung aus dem grünen Abschnitt in ein gut beschriftetes Ein-Milliliter-Mikrorohr übertragen. Geben Sie bis zu drei aus dem Feld entnommene DNA-Proben in das reine Probenfach eines feldbasierten qPCR-Instruments und stellen Sie eine Probe pro vorgesehener Sektion sicher.

Setzen Sie die Prüfstreifen für jede Probe in die entsprechenden A-, B- oder C-Streifenschlitze des Tabletts und richten Sie das erste Bohrloch jedes Streifens auf den ersten Schlitz des Tabletts aus. Entsperren Sie das Telefon und öffnen Sie die Anwendung, die nach dem markenrechtlich geschützten qPCR-Instrument benannt ist. Wenn die Anwendung geöffnet wird, tippen Sie auf die Schaltfläche Start Run.

Auf dem nächsten Bildschirm tippen Sie auf die Schaltfläche "IDs generieren". Geben Sie Beispielinformationen ein, indem Sie unter Beispiel-ID tippen und den Beispielnamen eingeben. Tappe die Probeneinheiten an und wähle die passende Einheit aus, tippe dann unter Probenmenge und gib das während der Extraktion verwendete Volumen ein.

Nachdem Sie die Informationen für alle Proben eingegeben haben, tippen Sie auf die Schaltfläche Fortsetzen. Auf dem nächsten Bildschirm tippen Sie auf das Ordnersymbol und dann auf Speichern im aktuellen Ordner. Gib einen Laufnamen ein und tippe auf Bestätigen.

Schalte das Instrument ein, indem du den Power-Knopf gedrückt hältst, bis alle vorderen Lichter leuchten. Tippen Sie im Antrag auf Bestätigen, um fortzufahren. Drücke Connect über integrierte Kurzstrecken-WLAN in der Anwendung.

Drücken Sie den integrierten Kurzstrecken-Drahtlosknopf am Instrument, bis das blaue Licht blinkt. Dann tippen Sie auf Bestätigen und wählen Sie den Namen des Instruments aus, um die Verbindung herzustellen. Entferne die Kappen von den Go-Streifenröhrchen für die erste Probe.

Gib jedem Brunnen 18 Mikroliter steriles Wasser hinzu und pipette vorsichtig, um das Pellet aufzulösen. Fügen Sie jedem Bohrloch zwei Mikroliter Probe hinzu und versiegeln Sie die Röhren mit Gummi-Prüfstreifenkappen, um die korrekte Ausrichtung sicherzustellen. Tippen Sie in der Anwendung auf Bestätigen, sobald alle Streifen vorbereitet sind.

Entfernen Sie jeden Prüfstreifen. Schau nach Blasen am Boden der Brunnen, dann schau den Streifen vorsichtig, bis die Blasen aufsteigen. Tippen Sie auf Bestätigen, um fortzufahren.

Öffnen Sie den Instrumentendeckel und legen Sie die Prüfstreifen in der richtigen Reihenfolge und Orientierung in das Instrument. Schließe den Deckel, bis er sich verriegelt, und tippe auf Bestätigen. Tippen Sie in der Anwendung auf den Start Run-Button, um den Durchlauf zu starten.

Wenn der Durchlauf beendet ist, tippen Sie auf E-Mail-Ergebnisse. Sobald Sie mit dem drahtlosen Internet verbunden sind, tippen Sie auf 'Erneut senden', um die Ergebnisse zu übertragen. Reinigen Sie das Becken zwischen den Durchläufen gründlich, um Kontaminationen zu vermeiden.

Der erfolgreiche Abschluss der DNA-Isolierung mit dem biologischen Extraktions-Feldkit wurde durch konsistente qPCR-Ergebnisse im Vergleich zu einer validierten laborbasierten Methode bestätigt. Die Standardkulturverdünnung von Dehalococcoides, analysiert mit der feldbasierten qPCR-Einheit, zeigte eine geringe Abweichung über 10 Wiederholungen bei sowohl 21 Grad Celsius als auch 30 Grad Celsius. Präzisionstests der Feldinstrumente zeigten eine relative Standardabweichung unter 5 % über alle Läufe.

Unsere Erkenntnisse bringen das Feld wirklich voran, indem sie Umweltüberwachung in diesen abgelegenen Orten ermöglichen, was die Zugänglichkeit, die Beteiligung der Gemeinschaft fördert und sehr wirkungsvolle wissenschaftliche Forschung ermöglicht. Unsere Ergebnisse ebneten den Weg für das Verständnis dafür, wie sich Proben während des Versands im Vergleich zur sofortigen Extraktion und Analyse verändern. Die zukünftige Forschung wird sich darauf konzentrieren, die Grenzen dieser Methoden für extreme Proben wie Salzlake sowie für extreme Wetterbedingungen zu definieren.