Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen
10. April 2026
Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.
Unsere Forschung untersucht erstmals die mitochondriale Morphologie terminaler Schwann-Zellen am neuromuskulären Übergang. Unser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in ansonsten schwer zugänglichen Geweben wie Kapillar- und Lymphbetten. Zu Beginn erhalten Sie eine Wildtyp-Maus und eine D2-mdx-Maus.
Nach Bestätigung der Anästhesietiefe durch einen Zehenknüpfreflex wird die Nadel an der distalen Sehne in Richtung des rechten Knies eingeführt. Injizieren Sie 50 Mikroliter zwei-mikromolare, weit rote, fluoreszierende mitochondriale Färbung auf das innere Tibialis, also den TA-Muskel, während Sie die Nadel entlang des Injektionswegs zurückziehen, und inkubieren Sie den Farbstoff in vivo für eine Stunde. Während Sie das Tier unter Narkose halten, verwenden Sie Schere und Pinzette, um den TA-Muskel vor der Euthanasie zu zerlegen und zu isolieren.
Lege den isolierten TA-Muskel 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd bei Zimmertemperatur. Dann trennen Sie die Fasern unter einem Stereomikroskop vorsichtig durch Teasing. Fügen Sie dem 4%-Paraformaldehyd Zellpermensäure-Färbung hinzu, um eine Endkonzentration von fünf bis 10 Mikrogramm pro Milliliter für die Kernkennzeichnung zu erhalten.
Waschen Sie dann den TA-Muskel dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten, um überschüssige Farbe zu entfernen. Dehydriere den Muskel nacheinander in jeweils 50 %, 75 % und 100 % Ethanol für jeweils fünf Minuten. Anschließend wird die Probe nacheinander in Gewebereinigungslösungen eins und zwei für jeweils 30 Minuten inkubiert, wobei sichergestellt wird, dass sie vollständig untergetaucht sind.
Legen Sie den Muskel auf einen Deckzettel. Verwenden Sie einen 2,5 mal 2 mal 1 Zentimeter großen Glasblock von 7,8 Gramm, um ihn vorsichtig abzuflachen. Besorge dir eine S100-Beta-Maus.
Nach Bestätigung der Anästhesietiefe durch den Zehenknurfreflex machen Sie einen kleinen Hautschnitt oberhalb des Musculus gluteus maximus (GM) (GM). Injizieren Sie 75 Mikroliter zwei-mikromolare weitrote fluoreszierende mitochondriale Färbung unter dem GM-Muskel. Schließe die Wunde und lasse den Farbstoff 45 Minuten lang inkubieren, um terminale Schwann-Zellen selektiv zu markieren.
Während Sie das Tier unter Narkose halten, sezieren Sie den gentechnisch veränderten Muskel innerhalb von 10 Minuten und legen Sie ihn sofort in gekühlte, 0,9 % sterile Kochsalzlösung. Nur bei Verwendung von D2-mdx-Mäusen wird ein fluoreszierender Acetylcholinrezeptor-Farbstoff mit einer Verdünnung von ein bis 500 % in das Mikrodissektionsbad gegeben und das Gewebe 30 Minuten lang inkubiert. Schneiden Sie überschüssiges Fett und Bindegewebe ab und legen Sie den GM-Muskel auf einen Deckschart mit der Bauchseite nach unten für die invertierte Mikroskopie.
Fügen Sie zwei Mikroliter allgemeines Befestigungsmedium auf die dorsale Oberfläche des GM hinzu und glätten Sie das Gewebe vor der Bildnahme mit Glasblock. In der Software stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 646 Nanometer ein. Nach dem Hinzufügen von zwei Tropfen Clearing-Lösung zwei wähle das 63X-Objektiv, um den TA-Muskel abzubilden, und setze die Z-Stack-Tiefe fast auf 100 Mikrometer.
Wählen Sie dann den Dekonvulutionsmodus und wenden systemoptimierte Parameter an. Stellen Sie die Schrittlänge auf einen Mikrometer ein und nehmen Sie Bilder auf. Um Bilder der terminalen Schwann-Zellen zu machen, wählen Sie das 20-fache Vergrößerungsobjektiv, stellen Sie die Z-Stack-Tiefe auf etwa 17 Mikrometer ein und nehmen Sie Bilder auf.
Wählen Sie dann das 63-fach vergrößerte Objektivobjektiv aus und machen Sie Bilder einzelner terminaler Schwann-Zellen. Importiere einzelne Z-Schnitte, um die Software darauf zu trainieren, das mitochondriale Signal zu erkennen. Und führen quantitative Analysen mit KI-gesteuerter Software durch.
Entwickeln Sie Bildmasken für die Überprüfung durch die Ermittler. Trennen Sie 3D-Bildstapel in einzelne optische Abschnitte nach der Algorithmusoptimierung. Wählen Sie jeden fünften Z-Schnitt aus jedem 3D-Bild aus und berechnen Sie den Durchschnitt pro Probe.
Standardisieren Sie Bildparameter über alle Proben und quantifizieren Sie die mitochondriale Morphologie. Führen Sie Immunhistochemie und statistische Analysen durch, um Gruppenunterschiede und Korrelationen zu bewerten. Die mitochondriale Konnektivität im MDX-Muskel war im Vergleich zu den Wildtypmäusen reduziert.
Eine größere Anzahl kleiner mitochondrialer Fragmente und eine reduzierte Anzahl großer, miteinander verbundener mitochondrialer Netzwerke wurden bei MDX-Mäusen beobachtet. Bei Wildtypmäusen wiesen Mitochondrien in terminalen Schwannzellen miteinander verbundene Schleifenstrukturen nahe Bifurkationen auf. Im Gegensatz dazu erschienen bei MDX-Mäusen die Mitochondrien fragmentiert und wiesen nahe Bifurkationen keine Schleifenbildungen auf.
Konfokale und Elektronenmikroskopie bestätigten ähnliche donutförmige mitochondriale Strukturen in terminalen Schwann-Zellen. Postsynaptische Analysen zeigten subsarkolemmige Mitochondrien, die um Acetylcholinrezeptoren gruppiert waren und die charakteristische brezelartige Struktur fehlten. Die Bildanalyse zeigte, dass terminale Schwann-Mitochondrien im MDX-Muskel eine größere Fläche und Fragmentierung im Vergleich zu Wildtyp-Muskeln aufwiesen, ohne Unterschied in der relativen Partikelgröße.
Messungen der Muskelkraft zeigten eine verminderte Zuckung mit größerer Variabilität und eine verringerte Spitzenkraft im MDX-Muskel. Die Kraftproduktion bei steigenden Stimulationsfrequenzen war ebenfalls signifikant in den MDX-Muskeln reduziert. Der MDX-Muskel zeigte eine nach links gerichtete Verschiebung der Fasergröße, was auf etwa 60 % kleinere Myofasern im Vergleich zum Wildtyp hindeutet.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die mitochondriale Morphologie in Skelettmuskeln und terminalen Schwannzellen zu untersuchen und zu quantifizieren. Zukünftige Studien können diesen Ansatz anpassen, um die mitochondriale Morphologie in Mikrozirkulationen und lymphatischen Gefäßen zu untersuchen.
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Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
