Name: Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie das Joint Space Analysis System (JSAS) für Rheumatologie-Forschung mit menschlichem Synovialgewebe kennen. Dieses ex vivo Modell ermöglicht die Untersuchung akuter Synovitis-Reaktionen unter kontrollierten Bedingungen.

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<table><tbody><tr><td>10 cm Petri dishes</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope probe</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24 well plates</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm biopsy punches</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicals</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol (zur Sterilisation)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borrelia burgdorferi</td><td>ATCC</td><td>35210&nbsp;</td><td>muss in der späten exponentiellen Phase für maximale Pathogenität verwendet werden</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO2-Tank (Standardbedingungen)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline (Ca-/Mg-)</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>Wärme inaktiviert Lot: F22100</td></tr><tr><td>Forceps (ohne Zähne)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Befeuchteter Zellinkubator (Standardbedingungen)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxie-Inkubator</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypoxie-Tank (5% O2, 5% CO2, Rest N2, physiologische Bedingungen)</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4-Antikörper</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS-Antikörper</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Iris-Schere</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit niedriger Glukose (+Natriumpyruvat, +L-Glutamin)</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9-Antikörper</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Modulare Inkubatorkammer (hyperoxische Bedingungen)</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Monozyten-Chemoattraktives Protein 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Muss für jedes Experiment frisch hergestellt und in äquimolarem Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 7-7,4 gepuffert werden</td></tr><tr><td>OPG ELISA</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 Verdünnung</td></tr><tr><td>Sauerstofftank mit Liter pro Minute Durchflussregler</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluoreszenz V2 Assay</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 Verdünnung</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA 300 MRSA</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10.000-facher Vorrat</td></tr><tr><td>TNF-Antikörper</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Transwell-Inserts - 0,4 µm Größe</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-Inserts - 5 µm Größe</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

ein präklinisches modell der synovitis unter verwendung ex vivo menschlichen synovialgewebes mit erhaltener funktion und architektur

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

Optimierung der Sauerstoffkulturbedingungen
Die physiologische Gewebeperfusion beträgt etwa 6–8 % Sauerstoff, während die Standardinkubationsbedingungen für Zellkultur atmosphärische Sauerstoffwerte (~21%)16 sind. Im Vergleich dazu kann Hyperoxygenierung die Lebensfähigkeit von Zellkulturen verbessern oder toxischsein. Eine ausreichende Nutzung von JSAS erforderte eine frühzeitige Bestimmung der Lebensfähigkeit des Synovialgewebe...

Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur

Arthritis is an inflammatory state within joints resulting in cartilage damage, pain, and loss of mobility. Recent advances in arthritis research ...

Die Hauptfragen, die wir beantworten möchten, sind, wie die native synoviale Immunantwort auf infektiöse und entzündliche Reize aussieht und wie sich dies in Veränderungen der Synovialstruktur widerspiegelt. Mein Hauptaugenmerk in Klinik und Forschung liegt auf der Behandlung von stark übergewichtigen Patienten mit RC-Arthritis im Endstadium. Häufig wurden diese Patienten in dieser Population medizinisch vernachlässigt, da es schwierig ist, chirurgische Behandlungsmöglichkeiten für ihre Erkrankung zu finden.Beginnen Sie mit einer Arthrotomie und Dissektion im Operationssaal. Verwenden Sie einen standardmäßigen medialen parapatellaren Zugang und führen Sie eine extensivere Exposition durch, wenn Sie an einem Patienten mit starker Adipositas und fortgeschrittener Arthrose operieren. Identifizieren Sie die vordere Synovialis und verwenden Sie Elektrokauter, um das Gewebe zu dissezieren.Beobachten Sie das Knie auf Anzeichen von Entzündungen, da Patienten mit Adipositas eine lokale Entzündungsreaktion aufweisen können, die mit den allgemeinen Entzündungseffekten der Adipositas korreliert. Übergeben Sie die Synovialis in steriler Weise an das Forschungsteammitglied. Legen Sie den mit kaltem Dulbecco's PBS oder DPBS gefüllten Probenbehälter auf Eis und übertragen Sie das menschliche vordere Synovialgewebe, das während der totalen Knieendoprothese gewonnen wurde, in den Behälter.Waschen Sie das Gewebe zweimal für 10 Minuten auf einem Plattenrocker in kaltem DPBS. Übertragen Sie dann die Synovialis in eine sterile Petrischale von 10 Zentimeter oder größer unter einem Biosicherheitsschrank der Stufe 2. Geben Sie kaltes, steriles DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, das Natriumpyruvat und L-Glutamin enthält, hinzu, um die Schale zur Hälfte zu füllen.Identifizieren Sie die synoviale Auskleidung durch die perlmuttartige Intimaschicht, ohne sie abzuschälen. Ordnen Sie die erforderlichen Werkzeuge an, um Biopsiekernen von mindestens drei Millimetern für mindestens zwei technische Wiederholungen zu erhalten. Verwenden Sie Iriszangen oder einen Skalpell, um das überschüssige Fett- und Stromagewebe von der gekochten Seite zu entfernen, um die Synovialis zu isolieren, wobei eine Gewebetiefe von etwa vier bis fünf Millimetern beibehalten wird.Wechseln Sie das Medien der Petrischale nach Bedarf, um das Sichtfeld zu erhalten. Positionieren Sie das Gewebe mit der synovialen Auskleidung zum Kernbohrwerkzeug hin. Stabilisieren Sie das Gewebe mit der nicht dominanten Hand mit Pinzetten oder Hämostatika und bohren Sie das Gewebe, indem Sie einen festen senkrechten Druck mit sanftem Drehen ausüben.Ersetzen Sie den Biopsiestempel nach etwa 10 bis 15 Verwendungen oder wenn sich das Gewebe beim Bohren verdreht, um eine Beschädigung der intimalen Auskleidungsstruktur zu vermeiden. Öffnen Sie eine zweite Petrischale und füllen Sie sie mit fünf bis 10 Millilitern Medium, das 10% FBS bei 37 Grad Celsius enthält. Übertragen Sie die Kerne mit flachen oder nicht gezahnten Pinzetten in die Schale und rühren Sie sie ein bis zwei Sekunden lang sanft um, um Schmutz zu entfernen, ohne sie fest zu quetschen.Um den Boden des Joint Space Analysis Systems vorzubereiten, geben Sie 600 Mikroliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt und 10%FBS bei 37 Grad Celsius hinzu. Fügen Sie die Fahrzeugkontrolle oder das Behandlungsreagenz Ihrer Wahl wie LPS oder MCP-1 dem Boden der Schale hinzu. Wählen Sie die Transwell-Porengröße basierend auf dem gewünschten experimentellen Ergebnis und fügen Sie 300 Mikroliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt und 10%FBS zum Transwell hinzu.Übertragen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig einzelne Gewebekerne in das Medium des Transwells und vermeiden Sie dabei ausgefranste und schwimmende Kerne. Platzieren Sie dann die Anordnung in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für acht bis 72 Stunden, je nach durchzuführenden Downstream-Assays. Fixieren Sie das synoviale Gewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin.Bettungen und schneiden Sie es dann für die histologische Analyse ein. Nach der Färbung mit Hämatoxylin und Eosin bilden Sie die Gewebeschnitte bei 10X und 40X mit einem Hellfeldmikroskop ab. Verwenden Sie Photoshop, um die intimale Auskleidung und die Sublining-Regionen im 40X TIFF-Bild zu umreißen, nicht-Zielbereiche, Erythrozyten und großes Vaskularsystem für die anschließende quantitative Analyse zu maskieren.Analysieren Sie die endgültigen Masken, um die Dicke, Integrität und Zellulärität der intimalen Auskleidung und des Sublinings zu quantifizieren. Beurteilen Sie schließlich die wandernden Zellen durch Durchflusszytometrie und die löslichen Faktoren im gesammelten Medium durch enzymgekoppelte Immunadsorptionstests. Das synoviale Gewebe, das mit zunehmenden Dosen von MCP-1 oder LPS kultiviert wurde, zeigte deutliche Veränderungen der intimalen Auskleidungsmorphologie, einschließlich einer brüchigen intimalen Auskleidung und einer verdickten intimalen Auskleidung mit verminderter Zelldichte im Vergleich zur Kontrolle.Die Behandlung mit MCP-1 und LPS veränderte die synoviale Zytokinantwort. MCP-1 induzierte die Expression von podoplaninem Markern pathogener Fibroblasten im Sublining, während LPS das Podoplanin sowohl in der intimalen Auskleidung als auch im Sublining erhöhte. Zu den wandernden Immunzellen im unteren Teil der Schale gehörten Neutrophile, NK-Zellen, NKT-Zellen, T-Zellen, B-Zellen oder dendritische Zellen, Monozyten oder Makrophagen und M2-Makrophagen.T-Zellen waren die häufigsten wandernden Immunzellen. Statistisch gab es keinen Unterschied in der Zellmigration basierend auf dem Stimulus des unteren Teils der Schale. Osteoprotegerin, ein für Arthritis relevantes Protein, wurde bei nicht behandeltem kultiviertem arthritischem Synovialgewebe nach 24, 48 und 72 Stunden nachgewiesen und war nach 72 Stunden signifikant höher als nach 24 Stunden.Die induzible Stickoxid-Synthase-Expression in der intimalen Auskleidung war bei den Kontrollen bei null Stunden hoch und war nach 24 Stunden nahezu nicht vorhanden. Die Expression der Stickoxid-Synthase wurde bei Behandlung mit N-Acetylcystein aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu veränderte N-Acetylcystein nicht die Matrix-Metalloproteinase-9-Expression, einen Marker sowohl für Synovitis als auch für potenzielle Knorpelschäden.Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Veränderungen in den synovialen intimalen und sublining Schichten zu untersuchen, einschließlich Tiefe, Zellulärität und Integrität, was alles auf eine Entzündung hinweist. Die wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung dieses Protokolls sind die Gewinnung von lebendem Gewebe von geeigneten Spendern, Sterilität und die Identifizierung der intimalen Auskleidung zur Biopsieauswahl. Zukünftige Studien werden die Verbesserung der Länge der Kultur von lebendem Gewebe bewerten, um die Regeneration der synovialen intimalen Auskleidung zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Bestimmung der räumlichen Ausdehnung der Zelle Verletzung/Tod auf die Gelenkfläche des intakten murinen Gelenke nach Anwendung der kontrollierten mechanischen Belastungen oder Auswirkungen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Arthrose, genetische Faktoren und/oder verschiedenen laden-Therapien die Verwundbarkeit der in Situ Chondrozyten auswirken.

Echtzeit-Visualisierung und Analyse der Knorpelzelltransplantation Verletzungen aufgrund der mechanischen Belastung in völlig intakt murinen Knorpel Explantaten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Isolierung und Kultivierung von Knorpelexpflanzen von Rinderknien beschreibt. Diese Methode bietet ein einfaches und zugängliches Werkzeug, um Gewebeveränderungen als Reaktion auf biologische Reize oder neuartige Therapeutika, die auf das Gelenk abzielen, zu beschreiben.

Ein Ex-Vivo-Gewebekulturmodell des Knorpel-Remodels in Rinderknie-Explants

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Wir stellen detaillierte Methoden zur Generierung von vier Gewebetypen aus humanen mesenchymalen Stammzellen vor, die zur Rekapitulation von Knorpel, Knochen, Fettpolster und Synovia im menschlichen Kniegelenk verwendet werden. Diese vier Gewebe werden in einen maßgeschneiderten Bioreaktor integriert und durch Mikrofluidik miteinander verbunden, so dass ein Kniegelenk-on-a-Chip entsteht.

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

Die vorliegende Studie bietet ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung von Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem entzündlichem Arthritisgewebe.

Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Hier stellen wir ein assembloides Modellsystem vor, um die zelluläre Wechselwirkung zwischen dem tragenden Sehnenkerngewebe und einem extrinsischen Kompartiment mit Zellpopulationen nachzuahmen, die durch Krankheit und Verletzung aktiviert werden. Als wichtigen Anwendungsfall demonstrieren wir, wie das System eingesetzt werden kann, um die krankheitsrelevante Aktivierung von extrinsischen Endothelzellen zu untersuchen.

Entwicklung von Sehnen-Assembloiden zur Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen bei Krankheit und Reparatur

Hier berichten wir über ein Protokoll, das ein Mausmodell für rheumatoide Arthritis (RA) durch adoptiven Transfer von CD4+ T-Zellen von SKG-Mäusen etabliert und ein schnelles und zuverlässiges experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der immunologischen Mechanismen, des pathologischen Fortschreitens und der Entwicklung neuer Therapien für RA bietet.

Ein adoptives Transfermodell der rheumatoiden Arthritis bei Mäusen

Darin beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) als zuverlässiges Modell zur Induktion von Kniearthrose bei Nagetieren und Methoden zur Entnahme von Kniesynovialflüssigkeit, zur Messung von Knieödemen und zur Beurteilung des Schweregrads der Osteoarthritis.

Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes und Synovialflüssigkeitsspülung in einem Nagetiermodell zur Untersuchung von Gelenkentzündungen und posttraumatischer Osteoarthritis

Ein neuer DC unabhängige Methode zur Induktion und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen beschrieben. HLA A2-Ig Basis künstlicher Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) sind mit HLA-A2 restringierte Peptide effizient erweitern CTL verschiedener Antigen-Spezifität geladen. Diese Technologie birgt ein großes Potenzial für die CTL-basierte adoptiven Immuntherapie.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

Lernen Sie das Joint Space Analysis System (JSAS) für Rheumatologie-Forschung mit menschlichem Synovialgewebe kennen. Dieses ex vivo Modell ermöglicht die Untersuchung akuter Synovitis-Reaktionen unter kontrollierten Bedingungen.

Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur (Video) | JoVE Journal

Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur

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