Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur

Die Hauptfragen, die wir beantworten möchten, sind, wie die native synoviale Immunantwort auf infektiöse und entzündliche Reize aussieht und wie sich dies in Veränderungen der Synovialstruktur widerspiegelt. Mein Hauptaugenmerk in Klinik und Forschung liegt auf der Behandlung von stark übergewichtigen Patienten mit RC-Arthritis im Endstadium. Häufig wurden diese Patienten in dieser Population medizinisch vernachlässigt, da es schwierig ist, chirurgische Behandlungsmöglichkeiten für ihre Erkrankung zu finden.

Beginnen Sie mit einer Arthrotomie und Dissektion im Operationssaal. Verwenden Sie einen standardmäßigen medialen parapatellaren Zugang und führen Sie eine extensivere Exposition durch, wenn Sie an einem Patienten mit starker Adipositas und fortgeschrittener Arthrose operieren. Identifizieren Sie die vordere Synovialis und verwenden Sie Elektrokauter, um das Gewebe zu dissezieren.

Beobachten Sie das Knie auf Anzeichen von Entzündungen, da Patienten mit Adipositas eine lokale Entzündungsreaktion aufweisen können, die mit den allgemeinen Entzündungseffekten der Adipositas korreliert. Übergeben Sie die Synovialis in steriler Weise an das Forschungsteammitglied. Legen Sie den mit kaltem Dulbecco's PBS oder DPBS gefüllten Probenbehälter auf Eis und übertragen Sie das menschliche vordere Synovialgewebe, das während der totalen Knieendoprothese gewonnen wurde, in den Behälter.

Waschen Sie das Gewebe zweimal für 10 Minuten auf einem Plattenrocker in kaltem DPBS. Übertragen Sie dann die Synovialis in eine sterile Petrischale von 10 Zentimeter oder größer unter einem Biosicherheitsschrank der Stufe 2. Geben Sie kaltes, steriles DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, das Natriumpyruvat und L-Glutamin enthält, hinzu, um die Schale zur Hälfte zu füllen.

Identifizieren Sie die synoviale Auskleidung durch die perlmuttartige Intimaschicht, ohne sie abzuschälen. Ordnen Sie die erforderlichen Werkzeuge an, um Biopsiekernen von mindestens drei Millimetern für mindestens zwei technische Wiederholungen zu erhalten. Verwenden Sie Iriszangen oder einen Skalpell, um das überschüssige Fett- und Stromagewebe von der gekochten Seite zu entfernen, um die Synovialis zu isolieren, wobei eine Gewebetiefe von etwa vier bis fünf Millimetern beibehalten wird.

Wechseln Sie das Medien der Petrischale nach Bedarf, um das Sichtfeld zu erhalten. Positionieren Sie das Gewebe mit der synovialen Auskleidung zum Kernbohrwerkzeug hin. Stabilisieren Sie das Gewebe mit der nicht dominanten Hand mit Pinzetten oder Hämostatika und bohren Sie das Gewebe, indem Sie einen festen senkrechten Druck mit sanftem Drehen ausüben.

Ersetzen Sie den Biopsiestempel nach etwa 10 bis 15 Verwendungen oder wenn sich das Gewebe beim Bohren verdreht, um eine Beschädigung der intimalen Auskleidungsstruktur zu vermeiden. Öffnen Sie eine zweite Petrischale und füllen Sie sie mit fünf bis 10 Millilitern Medium, das 10% FBS bei 37 Grad Celsius enthält. Übertragen Sie die Kerne mit flachen oder nicht gezahnten Pinzetten in die Schale und rühren Sie sie ein bis zwei Sekunden lang sanft um, um Schmutz zu entfernen, ohne sie fest zu quetschen.

Um den Boden des Joint Space Analysis Systems vorzubereiten, geben Sie 600 Mikroliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt und 10%FBS bei 37 Grad Celsius hinzu. Fügen Sie die Fahrzeugkontrolle oder das Behandlungsreagenz Ihrer Wahl wie LPS oder MCP-1 dem Boden der Schale hinzu. Wählen Sie die Transwell-Porengröße basierend auf dem gewünschten experimentellen Ergebnis und fügen Sie 300 Mikroliter DMEM mit niedrigem Glukosegehalt und 10%FBS zum Transwell hinzu.

Übertragen Sie mit sterilen Pinzetten vorsichtig einzelne Gewebekerne in das Medium des Transwells und vermeiden Sie dabei ausgefranste und schwimmende Kerne. Platzieren Sie dann die Anordnung in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für acht bis 72 Stunden, je nach durchzuführenden Downstream-Assays. Fixieren Sie das synoviale Gewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin.

Bettungen und schneiden Sie es dann für die histologische Analyse ein. Nach der Färbung mit Hämatoxylin und Eosin bilden Sie die Gewebeschnitte bei 10X und 40X mit einem Hellfeldmikroskop ab. Verwenden Sie Photoshop, um die intimale Auskleidung und die Sublining-Regionen im 40X TIFF-Bild zu umreißen, nicht-Zielbereiche, Erythrozyten und großes Vaskularsystem für die anschließende quantitative Analyse zu maskieren.

Analysieren Sie die endgültigen Masken, um die Dicke, Integrität und Zellulärität der intimalen Auskleidung und des Sublinings zu quantifizieren. Beurteilen Sie schließlich die wandernden Zellen durch Durchflusszytometrie und die löslichen Faktoren im gesammelten Medium durch enzymgekoppelte Immunadsorptionstests. Das synoviale Gewebe, das mit zunehmenden Dosen von MCP-1 oder LPS kultiviert wurde, zeigte deutliche Veränderungen der intimalen Auskleidungsmorphologie, einschließlich einer brüchigen intimalen Auskleidung und einer verdickten intimalen Auskleidung mit verminderter Zelldichte im Vergleich zur Kontrolle.

Die Behandlung mit MCP-1 und LPS veränderte die synoviale Zytokinantwort. MCP-1 induzierte die Expression von podoplaninem Markern pathogener Fibroblasten im Sublining, während LPS das Podoplanin sowohl in der intimalen Auskleidung als auch im Sublining erhöhte. Zu den wandernden Immunzellen im unteren Teil der Schale gehörten Neutrophile, NK-Zellen, NKT-Zellen, T-Zellen, B-Zellen oder dendritische Zellen, Monozyten oder Makrophagen und M2-Makrophagen.

T-Zellen waren die häufigsten wandernden Immunzellen. Statistisch gab es keinen Unterschied in der Zellmigration basierend auf dem Stimulus des unteren Teils der Schale. Osteoprotegerin, ein für Arthritis relevantes Protein, wurde bei nicht behandeltem kultiviertem arthritischem Synovialgewebe nach 24, 48 und 72 Stunden nachgewiesen und war nach 72 Stunden signifikant höher als nach 24 Stunden.

Die induzible Stickoxid-Synthase-Expression in der intimalen Auskleidung war bei den Kontrollen bei null Stunden hoch und war nach 24 Stunden nahezu nicht vorhanden. Die Expression der Stickoxid-Synthase wurde bei Behandlung mit N-Acetylcystein aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu veränderte N-Acetylcystein nicht die Matrix-Metalloproteinase-9-Expression, einen Marker sowohl für Synovitis als auch für potenzielle Knorpelschäden.

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Veränderungen in den synovialen intimalen und sublining Schichten zu untersuchen, einschließlich Tiefe, Zellulärität und Integrität, was alles auf eine Entzündung hinweist. Die wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung dieses Protokolls sind die Gewinnung von lebendem Gewebe von geeigneten Spendern, Sterilität und die Identifizierung der intimalen Auskleidung zur Biopsieauswahl. Zukünftige Studien werden die Verbesserung der Länge der Kultur von lebendem Gewebe bewerten, um die Regeneration der synovialen intimalen Auskleidung zu bewerten.