cholinerge ligandabhängige Modulation der oxidativen Phosphorylierungskopplung in Digitonin-permeabilisierten BE(2)-C-Neuroblastomzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine Methode zur Bewertung mitochondrialer Bioenergetik in intakten kultivierten Neuroblastomzellen mittels selektiver Permeabilisierung und Substratinhibitor-Kombination zu demonstrieren. Traditionell wird die mitochondriale Atmung mit Instrumenten wie dem Oroboros O2K Hochauflösungs-Respirometer, der Clark-Typ Sauerstoffelektrode und dem Seahorse XF-Analysator bewertet. Traditionelle Methoden, die auf isolierten oder angereicherten mitochondrialen Fraktionen aus Geweben oder Zellen beruhen, beeinträchtigen oft die mitochondriale Struktur.

Zum Beispiel zeigt dieses Transmissionselektronenmikroskopbild von aus dem Mauskortex isolierten Mitochondrien einen deutlichen Unterschied in der strukturellen Integrität, abhängig davon, ob die Mitochondrien in präsynaptischen Endpunkten eingeschlossen sind oder nicht. Mitochondrien, die in präsynaptischen Endpunkten eingeschlossen bleiben, erscheinen strukturell intakt, wie die cyanfarbenen Pfeile in diesem Bild zeigen. Im Gegensatz dazu erscheinen Mitochondrien, die nicht gekapselt sind oder keine umgebende membranöse Struktur haben, oft deformiert, wie die gelben Pfeile darstellen.

Der Seahorse Flex-Analysator wird häufig verwendet, um mitochondriale Bioenergetik sowohl in kultivierten Zellen als auch in isolierten Mitochondrien zu untersuchen. In der kultivierten zellbasierten Analyse sind zelluläre Architektur und Signalisierungsnetzwerke erhalten. Die Plasmamembran intakter Zellen ist jedoch für viele Tricarboxylsäure-Zyklussubstrate undurchlässig.

Dies begrenzt den Umfang der metabolischen Analyse im Vergleich zu isolierten Mitochondrien, die keine Plasmamembranbarriere besitzen, aber oft strukturelle Artefakte aufweisen. Daher haben beide Systeme inhärente Einschränkungen. Die hier vorgestellte Technik nutzt die Tatsache aus, dass die Plasmamembran reich an Cholesterin ist, während die mitochondriale Membran nur sehr wenig enthält.

Durch die Verwendung eines cholesterinbindenden Reinigungsmittels wie Digitonin können wir die Plasmamembran selektiv permeabilisieren, während die mitochondriale Membran intakt bleibt. Dieser Ansatz ermöglicht einen kontrollierten Eintritt von mitochondrialen Substraten und Inhibitoren in die Zelle, ohne die Integrität der Organelle zu gefährden. Diese Technik ermöglicht somit die funktionale Analyse von Mitochondrien im Kontext intakter Zellen, wobei der Vorteil der Ganzzellarchitektur mit der Zugänglichkeit isolierter mitochondrialer Assays kombiniert wird.

Beginnen Sie das Experiment mit einer subkonfluenten Kulturschale Ihrer Zellen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem sterilen Phosphatpuffer. Fügen Sie ein geeignetes Volumen Tritonlösung hinzu, um die Zellmonoschicht gleichmäßig zu bedecken. Nach der Inkubation entferne die Schale und klopfe oder schüttle sie vorsichtig horizontal, um die Zellen zu lösen.

Mit einem 5-ml-Pipetten- und Pipettenregler wird die Zellsuspension mehrmals hoch- und runtergepipettert, um einen Klumpen aufzulösen und eine einzellige Suspension zu erzielen. Untersuchen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop, um eine einheitliche Einzelzellsuspension zu bestätigen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.

Stellen Sie die Zellkonzentration so an, dass 100 Mikroliter der Suspension etwa 10.000 Zellen enthalten. Beschleunigen Sie vorsichtig 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Öffnung der Seahorse XF Prüfplatte. Lassen Sie einen Brunnen leer, um während des Tests als Hintergrundkontrolle zu dienen.

Inkubieren Sie die Platte zwei bis drei Stunden in einem Zellkulturinkubator, damit die Zellen am Boden des Brunnens haften können. Sobald die Zellen angesetzt sind, geben Sie vorsichtig 300 Mikroliter Prüfmedium zu jedem Brunnen. Bringen Sie die Platte zurück in den Inkubator und brüten Sie sie über Nacht aus, damit sich die Zellen stabilisieren und wachsen können.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen eine gleichmäßige Monoschicht über den Boden jedes Bohrlochs bilden. Vermeiden Sie Überfüllung. Die Zellen sollten konfluent, aber nicht überkonfluent sein, um eine optimale Testleistung zu gewährleisten.

Am Abend vor dem Experiment hydratisieren Sie die XFp 24 Sensorkartusche, indem Sie jedem Bohrloch einen ml Kalibrierungspuffer hinzufügen. Alternativ können Sie Phosphatpuffer-Kochsalzlösung mit pH 7,4 verwenden. Lass die Kartusche über Nacht auf dem Bett bei Zimmertemperatur liegen.

Eine Inkubation in einem Nicht-COT-Inkubator bei 37 Grad Celsius ist nicht erforderlich, da die Kartusche sich während des Ladevorgangs auf Raumtemperatur anpasst. Ruf alle Tiefkühlprodukte und 2x Mikroglial-Assay-Puffer bei Raumtemperatur an. Prüfe den pH-Wert, er sollte 7,4 sein.

Passen Sie es bei Bedarf an. Bereiten Sie alle Substrat- und Injektionslösungen vor und überprüfen Sie erneut den pH-Wert. Lassen Sie alle Lösungen bis zur Anwendung auf Eis.

Bereiten Sie Lebensmittelröhrchen mit den Beschriftungen A, B, C und D für Lösungen für die Sensorpatronen-Einspritzporte vor. Am besten ist es, Lösungen herzustellen, die für jeden Port die jeweiligen Inhibitoren oder Substrate enthalten. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 Mikroliter jeder Einspritzportlösung vorsichtig in die jeweiligen Anschlüsse von A bis D geladen.

Starten Sie den Seahorse-Bioanalysator ein bis zwei Stunden vor dem Experiment, damit der interne Inkubator sich bei 37 Grad Celsius stabilisieren kann. Beschrifte jeden Brunnen und gruppiere sie nach deinem Versuchsdesign und den Richtlinien von Wave Desktop 2.6. Programmieren Sie den Bioanalysator für die passende Mischung, das richtige Gewicht und den Messzyklus.

Siehe Tabelle 8 zur Referenz. Es ist wichtig, die Gleichgewichtsoption zu Beginn des Messzyklus zu deaktivieren. Wenn man ihn drauflässt, verlängert das Experiment unnötig und kann die Substrate erschöpfen.

Starte die Maschine. Die Maschine kalibriert zuerst die Sensorpatrone, was etwa 15 Minuten dauert. Beginnen Sie direkt mit der Vorbereitung der Zellplatte nach dem Kalibrieren der Sensorkartusche. Saugen Sie den Puffer vorsichtig ohne Störung der Zellen mit etwa 700 Mikrolitern 1x mitochondrialem Puffer in jede Welle mit haftenden Zellen ab und lassen Sie die Platte eine Minute zum Gleichgewicht ruhen.

Saugen Sie den Puffer vorsichtig aus jedem Brunnen ab, ohne die adhärenten Zellen zu stören. Wiederhole den Waschmaschinenschritt dreimal, um ein vollständiges Medium sicherzustellen. Parallel dazu fügen Sie 50 Mikroliter mitochondrialen Testpuffer zu einem zellfreien Hintergrundbrunnen hinzu.

Nutze den Meniskus als visuelle Referenz für Volumenkonsistenz. Saugen Sie den Puffer vorsichtig aus den zellhaltigen Brunnen, wobei etwa 50 Mikroliter übrig bleiben, um die Zellhydration aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, entweder in einem Wasserbad und halten Sie sie über der Wasseroberfläche oder in einem nicht-stahlhaltigen Inkubator mit einer gesättigten Atmosphäre, um Verdunstung zu verhindern.

Bevor Sie in den Analysator geladen werden, fügen Sie jedem Brunnen 450 Mikroliter vorgewärmten mitochondrialen Assay-Puffer mit Prüfsubstraten, Inhibitoren oder Medikamenten hinzu, sodass das Gesamtvolumen auf 500 Mikroliter steigt. Die Platte ist nun bereit, den Test mit der kalibrierten Sensorpatrone im Seahorse-Bioanalysator durchzuführen. Zunächst führen wir einen Kopplungstest durch, um den Grad der Kopplung zwischen dem Elektronentransportsystem und der oxidativen Phosphorylierung zu untersuchen.

Der Kopplungstest hilft, mitochondriale Funktion von Dysfunktion zu unterscheiden. In diesem Diagramm des mitochondrialen Elektronentransportsystems zeigen wir komplexe Eins-, Drei- und Fünf-spezifische Inhibitoren zusammen mit den Knoten für verschiedene Substrate wie Pyruvat oder Malat und Succinate, die die Elektronen an das System spenden. Diese Visualisierung ist nützlich, um zu verstehen, wie der Test funktioniert und welche Rolle verschiedene Substrate und Inhibitoren spielen.

Zunächst untersuchen wir zwei verschiedene Digitoninkonzentrationen, fünf Mikromolare und 10 Mikromolare, hinsichtlich ihrer Wirksamkeit bei der Erleichterung des Elektronentransports über die Plasmamembran und der Ermöglichung des Kopplungsassays. In diesem Test wurde das Ausmaß der respiratorischen Kopplung durch sequentielle Messung der Sauerstoffverbrauchsrate in Anwesenheit von Succinat als Substrat und Rotenon als Komplex-ein-Inhibitor bewertet. ADP, Oligomycin, FCCP und Antimycin A wurden dann nacheinander injiziert, und nach jeder Injektion wurden OCR-Messungen erfasst.

Das linke Panel zeigt Liniendiagramme, die die kinetische Sauerstoffspannung innerhalb der transienten Mikrokammer darstellen. Typischerweise sollte dieser Wert zwischen 100 und 200 Millimeter Quecksilber liegen, um die Detektion im Dynamikbereich des Sensors sicherzustellen. Diese Datensätze wurden mit dem Punkt-zu-Punkt-Modus in der Agilent Wave-Software generiert, die OCR als eine Reihe von Raten über den Messzeitraum anzeigt und so die Visualisierung dynamischer Veränderungen ermöglicht, insbesondere durch 10 Mikromolare Digitonin, erhöhte Succinattransporte im Vergleich zu fünf Mikromolaren den Succinattransport, was zu einer geringeren Sauerstoffspannung in der Mikrokammer und entsprechend einer höheren Sauerstoffaufnahme führte.

Das Plotten der aus diesen Experimenten gewonnenen Daten zeigte, dass die basale Atmung, vermittelt durch Komplexe zwei bis vier, mit 10 mikromolaren Digitonin signifikant höher war als bei fünf Mikromolaren, was auf einen effizienteren Succinattransport über die permeabilisierte Plasmamembran bei höherer Konzentration hinweist. Basierend auf dieser Beobachtung und da 10 mikromolare Digitonin eine optimale Permeabilisierung bietet, reduzierten wir anschließend die Zellzahl auf 20.000 Zellen pro Bohrloch, um die basale Atmung zu senken. Diese Anpassung stellte sicher, dass jegliche durch Medikamente oder Substrat induzierte Atemverstärkung im dynamischen Detektionsbereich des Systems blieb.

Nachdem die Digitoninkonzentration und Zellzahl optimiert waren, wurde der nächste Kopplungstest durchgeführt, um die Auswirkungen muskarinischer Agonisten und Antagonisten auf die mitochondriale Atmung zu bewerten. Eine wichtige Erkenntnis aus dieser Experimentreihe war, dass in unbehandelten Digitonin-Zellen die basale Atmung, vermittelt durch Succinat-getriebene Komplexe zwei bis vier, sowie die State-3- und State-3u-Atmung signifikant reduziert waren. Dies deutet darauf hin, dass Succinat unter nicht-permeabilisierten Bedingungen nicht in die Zelle transportiert wurde.

Die Darstellung der Daten aus mehreren unabhängigen Experimenten zeigte, dass der muskarinische Antagonist Atropin die basale Atmung, vermittelt durch die Komplexe zwei bis vier in der Neuroblastomzelle, im Vergleich zum muskarinischen Agonisten Acetylcholin, der ein hohes Atmungsniveau aufrechterhielt, signifikant reduzierte. Darüber hinaus waren sowohl die State-3- als auch State-3u-Atmung in nicht-permeabilisierten Zellen signifikant niedriger als in permeabilisierten Zellen, was die Wirksamkeit von Digitonin bei der selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran unterstreicht, ohne die mitochondriale Funktion zu beeinträchtigen. Der Elektronenflussassay bewertet den sequentiellen Transfer von Elektronen zur mitochondrialen Elektronentransportkette und hilft dabei, Mechanismen der mitochondrialen Dysfunktion oder Modulation zu identifizieren.

In der Anfangsphase des Tests wurden die Zellen mit Pyruvat, Malat und FCCP behandelt, was ein hohes Maß an ungekoppelter Atmung auslöste, verursacht durch die Komplexe eins bis vier. Die anschließende Zugabe von Rotenon hemmte Komplex eins, reduzierte die basale Atmung und isolierte die Aktivität des Komplexes zwei bis vier. Obwohl wir keine signifikanten Unterschiede zwischen medikamentenbehandelten Erkrankungen und Kontrolle beobachteten, war eine wichtige Beobachtung, dass die durch Succinate getriebene State-3u-Atmung in nichtpermeabilisierten Zellen signifikant niedriger war, was auf die entscheidende Rolle von Digitonin beim Eindringen von Succinaten in die Zelle hinweist.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll eine zuverlässige Methode zur Untersuchung mitochondrialer Bioenergetik. Es verbindet die physiologische Relevanz der Ganzzellarchitektur mit der Präzision isolierter mitochondrialer Assays und ermöglicht so eine kontrollierte Abgabe von Substraten und Inhibitoren bei gleichzeitiger Erhaltung der Organellenintegrität. Durch die Optimierung der Digitoninkonzentration und Zelldichte können Forscher genaue und reproduzierbare Messungen erzielen.

Dieser anpassungsfähige Ansatz ist ideal, um rezeptorvermittelte Modulation der mitochondrialen Funktion zu erforschen und bietet eine leistungsstarke Plattform für Krankheitsforschung und Arzneimittelentwicklung.