Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, wie epigenetische Regulation die Genexpression formt, insbesondere wie Chromatin- Zugänglichkeit die Genaktivität unter verschiedenen biologischen Bedingungen kontrolliert. ATAC-seq in C. elegans ist durch seine schützende Cuticula eingeschränkt. Unsere Protokolle überwinden diese Barriere, um eine zuverlässige Analyse der Chromatin-Zugänglichkeit zu ermöglichen.

Zum Beginn erhalten Sie eine synchrone Population von L1-Würmern und lassen Sie sie 26 Stunden bei 20 Grad Celsius wachsen. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop, dass die meisten Würmer im L4-Stadium sind. Rekuperieren Sie alle Würmer von den Platten mit M9-Puffer und übertragen Sie sie in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr.

Waschen Sie die Würmer fünfmal mit einem Milliliter sterilem Wasser, indem Sie sie durch Schwerkraft absetzen lassen. Übertragen Sie anschließend das Rohr mit den Würmern für 30 Minuten in einen 25 Grad Celsius Inkubator, um intestinale Nahrungsreste zu entfernen. Nehmen Sie dann 50 Mikroliter des Wurm-Pellets und geben Sie es in ein neues Rohr.

Um die Würmer zu lysieren, fügen Sie 200 Mikroliter frischen SDS-DTT-Puffer hinzu und mischen Sie ihn in einem Tube Rotator für genau fünf Minuten. Fügen Sie dann ein Milliliter kalten Ei-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie dann in einer Picofuge, um den Überstand zu entfernen, und wiederholen Sie dies sechsmal.

Fügen Sie danach 80 Mikroliter frisch zubereitetes Pronase hinzu. Mischen Sie die Wurm-Pronase-Mischung 70 Mal mit einer 200 Mikroliter Pipette mit gefilterten Spitzen und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Fügen Sie 800 Mikroliter L15 10% fetales Rinderserum Medium hinzu und zentrifugieren Sie bei 500G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Folgende Entfernung des Überstandes, fügen Sie ein Milliliter L15 10% fetales Rinderserum Medium hinzu und zentrifugieren Sie wie zuvor demonstriert. Sobald der Pellet dreimal gewaschen ist, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie den Pellet in 900 Mikrolitern L15 10% fetales Rinderserum Medium neu. Filtern Sie dann die Suspension durch einen 20 Mikrometer Filter.

Zentrifugieren Sie die filtrierte Zellsuspension bei 500G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand und lassen Sie ungefähr 50 Mikroliter. Fügen Sie 45 Mikroliter frisch zubereiteten Lysepuffers hinzu und suspendieren Sie die Probe vorsichtig neu.

Fügen Sie dann vorsichtig 50 Mikroliter Waschpuffer hinzu, ohne die Probe zu mischen. Zentrifugieren Sie bei 500G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und halten Sie die Probe auf Eis.

Während der Zentrifugation bereiten Sie das TN5-Gemisch pro Probe vor, indem Sie 25 Mikroliter TN5-Puffer, 24,8 Mikroliter nuclease-freies Wasser und 0,2 Mikroliter TN5-Enzym kombinieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und halten Sie die Kerne auf Eis. Fügen Sie 50 Mikroliter TN5-Gemisch zum nuklearen Pellet hinzu.

Pipettieren Sie es dann siebenmal auf und ab, um es zu mischen. Inkuieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten auf einem Thermoblock und klopfen Sie alle 10 Minuten sanft an das Rohr. Nach der TN5-Inkubation fügen Sie 300 Mikroliter PB-Puffer hinzu und mischen Sie durch Vortexen bei maximaler Geschwindigkeit für 25 Sekunden.

Übertragen Sie das gesamte Volumen aus dem Rohr in die Spin-Säule. Zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur für eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit. Fügen Sie 750 Mikroliter PE-Puffer zur Spin-Säule hinzu und zentrifugieren Sie erneut.

Entsorgen Sie dann den Überstand mit dem Sammelrohr. Nach einem leeren Spin platzieren Sie die Säule in einem neuen beschrifteten 1,5 Milliliter Rohr. Fügen Sie 10 Mikroliter EB-Puffer bei 37 Grad Celsius zur Mitte der Säule hinzu, ohne diese zu berühren.

Lassen Sie es bei Raumtemperatur für eine Minute. Zentrifugieren Sie dann für eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann die Elutionsschritte, um ein Endvolumen von 20 Mikrolitern in EB-Puffer zu erhalten.

Führen Sie eine Echtzeit-PCR durch, um die richtige Zyklusverstärkungszahl für die ATAC-Bibliotheksverstärkung zu schätzen. Schätzen Sie die endgültige Verstärkungszykluszahl, indem Sie den Zyklus auswählen, bei dem das Verstärkungssignal 1/3 seines Maximums für jede Probe erreicht. Führen Sie die endgültige Verstärkung für die ATAC-Bibliothek durch und weisen Sie jeder Probe einen anderen Reverse-Primer zu und notieren Sie ihn.

Verstärken Sie jede Probe für die geschätzte Zyklusanzahl für diese Probe. Führen Sie die dargestellte Polymerase-Kettenreaktion in 200 Mikroliter Röhrchen mit 10 Mikroliter DNA-Bibliothek in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikrolitern durch. Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, wenn das Protokoll pausiert wird.

Nach der Reinigung der amplifizierten Bibliothek führen Sie eine Kapillarelektrophorese durch, um das Fragmentgrößenverteilungsmuster zu sehen. Die Verstärkungskurve, die zu einer geschätzten endgültigen Bibliotheksverstärkung von weniger als 15 Zyklen führt, zeigt gutes Material an, das für die Fortsetzung geeignet ist. Die Verstärkungskurve, die einen verzögerten Anstieg zeigt, weist auf Material von schlechter Qualität hin und sollte nicht fortgesetzt werden.

Die Fragmentlängenverteilung nach der Amplifikation zeigte nukleosomale Muster bei etwa 150 Basenpaaren und 300 Basenpaaren in gültigen Proben. Ein verschmierter Fragmentmuster weist auf übermäßig tagmentierte DNA hin, die eine Wiederholung der Probe erfordert. Unser Protokoll wird die genomweite Chromatin-Zugänglichkeitsprofilierung in ganzen Würmern ermöglichen, um zu verstehen, wie Umgebungen die Genregulation beeinflussen.

Die Hauptherausforderung besteht darin, die Würmer-Eingabe und die TN5-Aktivität auszugleichen, um eine unzureichende oder übermäßige Tagmentation zu vermeiden und eine optimale Chromatin-Zugänglichkeitsprofilierung sicherzustellen. Dieser Ansatz eröffnet Möglichkeiten, epigenetische Variationen über Wildisolate, Umweltbedingungen und sogar alternative Arten hinweg zu untersuchen.