Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse
17. April 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.
Unsere Forschung untersucht hauptsächlich die hepatozytenbezogene Pathophysiologie im Kontext chronischer Lebererkrankungen. Dieses Protokoll ermöglicht die Zellisolierung in Lebergewebeschnitten und die RNA-Extraktion. Im Gegensatz zu FFPE, Paraformaldehyd-fixierten oder CT-Protokollen konservieren und itegratiert, was präzise Mikrodiskussionen und hochwertige Proben für die nachgelagerte OMI-Analyse ermöglicht.
Um zu beginnen, belichte die Stiftmembranfolien ultraviolettem Licht in vier 30 Minuten. Beschichten Sie die Objektträger mit 0,1 Milligramm Poly-L-Lysin pro Milliliter und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Versiegeln Sie die Kanten jedes Schlittens mit einem neutralen Befestigungsmedium.
Mit einem RNase-Dekontaminationsmittel werden alle zugänglichen Oberflächen des Kryostats und alle Werkzeuge gewischt. Ich benutze 75 % Ethanol. Reinige die Bürste und die Werkzeuge gründlich.
Stellen Sie nun die Temperatur des Kryostatens auf minus 20 Grad Celsius ein und lassen Sie sich stabilisieren. Entnehmen Sie die Leberproben aus der Lagerung von minus 80 Grad Celsius. Legen Sie die Proben mindestens 15 Minuten lang in die Kryostatkammer, um das Gleichgewicht zu erreichen.
Tragen Sie eine zwei bis drei Millimeter dicke Schicht OCT-Verbindung auf die Probephase auf. Dann wird die Probestufe auf ein schnelles freies Regal oder in die Kryostatkammer gelegt, um die Verbindungsschicht vorab zu verfestigen. Nachdem Sie eine kleine Menge OCT-Verbindung auf die vorgefestigte Schicht aufgetragen haben, legen Sie den ausgeglichenen Gewebeblock horizontal auf die Verbindung und halten Sie ihn 10 bis 15 Sekunden lang an Ort und Stelle.
Dann montieren Sie die Probenstufe mit dem befestigten Gewebeblock auf den Kopf des Kryostaten. Jetzt stecken Sie die Klinge vorsichtig zwischen die Klemmplatten und Rückplatten von einer Seite des Kryostat. Klemme den Klemmhebel, um die Klinge zu sichern.
Stellen Sie die Kryostatdicke auf 10 Mikrometer ein. Schneiden Sie das Gewebe in Abschnitte und montieren Sie sie direkt auf die vorbehandelten Stiftmembranen im Inneren der Kryostatkammer, die bei minus 20 Grad Celsius gehalten werden. Tauen Sie die Objektträger 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur auf.
Wasche die Folien dreimal mit RN ACE Free PBS vier 10 Sekunden pro Waschen. Gib die gefilterte Mayer-Hämatoxylin-Lösung fünf bis zehn Sekunden lang auf die Gewebeabschnitte. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal mit Ribonuklease-freiem Wasser für jeweils 10 Sekunden, um die restlichen Hämatoxylin zu entfernen.
Beurteilen Sie die Färbungsqualität unter dem Mikroskop. Mit saugfähigem Papier tupfen Sie die Objektträger trocken und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Wischen Sie die Labortischoberfläche mit dem RNase-Dekontaminationsmittel ab.
Schalten Sie den Controller ein und lassen Sie das Mikroskop die Initialisierung abschließen. Drehen Sie den Schlüssel im Uhrzeigersinn von der aus- zur ein-Position, um das Lasersystem zu starten. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Laseraufnahme-Mikrodissektionssoftware.
Dann warten Sie, bis die Initialisierung abgeschlossen ist. Führen Sie nun ein steriles 0,2-Milliliter-PCR-Rohr in das Sammelgerät. Mit einer Pipette geben Sie 10 Mikroliter Protease-K-Verdauungspuffer an die Kappe des PCR-Rohrs.
Laden Sie das Sammelgerät in den Halter der Mikroskopprobe. Im Fenster für das Änderungssammler-Gerät. Gehe zum Referenzpunkt anpassen, stelle den Kamerafokus an, um den Referenzpunkt klar zu sehen, und benutze die Pfeilregler, um ihn bei Bedarf zu zentrieren.
Laden Sie einen Gewebeschnitt in den Probenhalter, wobei das Gewebe nach unten zeigt und das Etikett rechts liegt. Wählen Sie die 10-fache Objektivlinse und identifizieren Sie Interessengebiete mit spezifischen pathologischen Merkmalen. Navigiere zum Lasermenü.
Klicken Sie auf Kalibrieren, wählen Sie Ja und schließen Sie die Kalibrierung ab. Im Laserbedienfeld stellen Sie die Laserleistung auf 50, die Blende auf fünf und die Geschwindigkeit auf neun ein. Dann verwenden Sie die grafische Symbolleiste, um einen Kreis um den Zielbereich zu zeichnen.
Wählen Sie eine einzelne Form, drücken Sie auf Start Cut, um eine Laseraufnahme-Mikrodissektion durchzuführen, und positionieren Sie das Sammelgerät, um das dissektionierte Gewebe zu sammeln. Um die Dokumentation zu erfassen, wählen Sie Bilder aus und wählen Sie Bilder speichern, um Vorher- und Nachherbilder im bevorzugten Format zu speichern. Nachdem Sie die gewünschten Zellen gesammelt haben, klicken Sie auf Entladen, um den Kollektor aus der Stufe zu entfernen.
Überprüfen Sie, dass 10 Mikroliter Protease-K-Verdauungspuffer im Deckel verbleiben, und füllen Sie es bei Bedarf wieder auf. Schließe das Rohr und wirbel es gründlich vortex. Dann drehen Sie das Rohr kurz in einer Zentrifuge.
Lagere das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Extraktion. Der mit Hämatoxylin gefärbte Leberabschnitt auf dem Stift-Objektträger wurde vor und nach der Laser-Capture-Mikrodissektion unter dem Mikroskop visualisiert. Interessensgebiete mit mikrovesikulärer Steatose wurden präzise in die Kappe des A-PCR-Rohrs gesammelt.
Bewahrung intakter zellulärer Morphologie. Die gesamte Ribonukleinsäure, die aus etwa 1000 und 2000 isolierten Laser-Capture-Mikrodissektionszellen extrahiert wurde, ergab jeweils 110,7 Nanogramm bzw. 213,3 Nanogramm. Alle Proben zeigten eine hohe Reinheit mit Absorptionsverhältnissen von 260 mal 280 Nanometern zwischen 1,9 und 2,1.
Die Gelelektrophorese zeigte deutliche 28-s- und 18-s-Ribosom-Ribo-Nukleinsäurebänder. Bioanalysatorprofile von Ribonukleinsäure aus so wenigen wie 1000 Zellen. Gab eine Ribonukleinsäure-Integritätszahl von 6,7 an.
Q-R-T-P-C-R für das Housekeeping-Gen Beta-Aktin ergab Zyklus-Schwellenwerte von 17 bis 19. Die Bewertung der Sequenzierungen durch Bioanalysatoren, die aus 50 Nanogramm der gesamten Ribonukleinsäure konstruiert wurden, zeigte einen charakteristischen Peak zwischen 300 und 500 Basenpaaren. Die RNA-Sequenzierung dieser Bibliotheken lieferte hochwertige Daten mit sowohl Q20- als auch Q30-Werten, die über 90 % und eine niedrige Fehlerquote bei den Replikaten erzielten.
Ein wichtiger Aspekt ist die Verhinderung von Abbauschutz durch Kontrollstopp, schnelle Färbung und gerade Bedingungen durch unsere Verarbeitung. Ordnet man dieses Verfahren, kann es für Echtzeit-PCR und eine Sequenzierung mit fragmentierungsoptimierten Bibliotheksschlüsseln verwendet werden. Etabliert in Leberproben.
Dieses Protokoll ermöglicht das Profilieren von Hepatozyten-Subgruppen und unterstützt pathologieorientierte Hepatologieforschung.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die Laser-Kapture-Mikrodissektion (LCM) und die RNA-Extraktion aus paraformaldehyd (PFA)-fixierten, OCT-eingebetteten Mausleber-Schnitten vor. Die Methode ermöglicht die Isolierung spezifischer histologischer Regionen für nachgeschaltete transkriptomische Analysen und gewährleistet eine hohe RNA-Reinheit und -Integrität, die für empfindliche Anwendungen wie qPCR und RNA-Sequenzierung geeignet ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Hepatologie
- Molekularbiologie
- Histologie
Hintergrund
- Chronische Lebererkrankungen erfordern häufig eine räumlich aufgelöste molekulare Analyse von Hepatozyten-Subpopulationen.
- Herkömmliche FFPE-Methoden können die RNA-Integrität beeinträchtigen und damit nachgeschaltete Anwendungen einschränken.
- Die Lasermikrodissektion ermöglicht die gezielte Isolierung definierter Zellpopulationen aus komplexen Geweben.
- PFA-Fixierung und OCT-Einbettung bewahren die Gewebemorphologie sowie die RNA-Qualität für transkriptomische Untersuchungen.
Zweck der Studie
- Etablierung eines robusten Protokolls zur Isolierung spezifischer Leberzellpopulationen mittels LCM aus PFA-fixiertem, OCT-einbettetem Gewebe.
- Gewinnung von hochwertiger RNA, die für transkriptomische Analysen aus mikroskaligen Proben geeignet ist.
- Überprüfung der Effektivität des Protokolls für nachgeschaltete Anwendungen wie qPCR und RNA-Sequenzierung.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Pen-Membran-Präparaten mit UV-Bestrahlung und Beschichtung mit Poly-L-Lysin.
- Kryoschnitte von PFA-fixierter, OCT-eingebetteter Mausleber bei -20 °C.
- Farbung mit Hämaluminium und RNAse-freie Handhabung während des gesamten Arbeitsablaufs.
- Laser-Mikrodissektion histologisch definierter Regionen (ca. 1.000 Zellen).
- RNA-Extraktion, Quantifizierung und Qualitätsbeurteilung (A260/A280-Verhältnis, RIN, Gelelektrophorese).
- Nachgeschaltete Validierung mittels qPCR für β-Aktin und RNA-Sequenzierung mit fragmentierungsoptimierter Bibliotheksherstellung.
Hauptergebnisse
- Die RNA-Ausbeute aus 1.000–2.000 Zellen lag zwischen 110,7 und 213,3 ng.
- Die RNA-Reinheit war hoch (A260/A280: 1,9–2,1).
- Die RNA-Integritätszahl (RIN) betrug durchschnittlich 6,7 ± 0,9, was mit einer PFA-Fixierung vereinbar ist.
- Die qPCR für β-Aktin zeigte Ct-Werte von 17–19, was auf eine gute RNA-Qualität hinweist.
- Die RNA-seq-Bibliotheken wiesen charakteristische Peaks (300–500 bp) auf, und mehr als 90 % der Basen erreichten die Qualitätsstufen Q20/Q30.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise, räumlich aufgelöste Analyse der Genexpression in Lebergewebe.
- Die extrahierte RNA weist eine ausreichende Reinheit und Integrität für empfindliche nachgeschaltete Anwendungen auf.
- Die Methode unterstützt die Profilierung von Hepatozyt-Untergruppen und die pathologiefokussierte hepatologische Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Mittels Laser-Kapture-Mikrodissektion (LCM) von paraformaldehyd-fixiertem, OCT-eingebettetem Mauslebergewebe lässt sich eine ortsauflösende transkriptomische Profilierung definierter Zellpopulationen durchführen, was der mechanistischen Ent-Risikobewertung in der frühen Forschung dient. Dieser Ansatz liefert RNA hoher Reinheit, die für empfindliche nachgeschaltete Analysen geeignet ist, und ermöglicht eine zuverlässige Zielvalidierung sowie die Untersuchung krankheitsrelevanter Signalwege. Das Protokoll adressiert einen kritischen Wendepunkt für forschungs- und entwicklungsspezifische Portfolios im Bereich Hepatologie und Pathologie, die robuste, regionspezifische molekulare Erkenntnisse anstreben.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine räumlich präzise Untersuchung von Hepatozyt-Untergruppen innerhalb komplexen Lebergewebes.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem histologisch definierte Regionen für die RNA-Analyse isoliert werden.
- Erleichtert die mechanistische Entwicklungsrisikominderung, indem molekulare Signaturprofile mit spezifischen pathologischen Merkmalen verknüpft werden.
- Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Portfolio-Priorisierung, indem hochwertige, regionspezifische RNA-Daten bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte biologische Proben für nachgeschaltete qPCR- und RNA-Sequenzierungsabläufe vor.
- Stellt die Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte Gewebeaufarbeitung und RNA-Qualitätsmetriken sicher.
- Liefert quantitative Ergebnisse (z. B. Ct-Werte, RNA-Integrität) für eine zuverlässige Wirkstoffbewertung.
- Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform für mehrere transkriptomische Anwendungen in Modellen der Lebererkrankung.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt die molekulare Profilierung mit krankheitsrelevanten histopathologischen Befunden zur translationale Biomarker-Entdeckung.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem empfindliche, auf RNA basierende Analysen unterstützt werden.
- Verringert das biologische Risiko bei Entscheidungen über den präklinischen Fortschritt, indem die Probenechtheit und Datenqualität sichergestellt wird.
- Unterstützt die pathologiegeleitete Forschung in Modellen chronischer Lebererkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses LCM-Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem es eine gezielte Genexpressionsanalyse aus fixierten Gewebeschnitten ermöglicht und so eine Brücke zwischen der histologischen Beurteilung und molekularen Messwerten schlägt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht räumlich aufgelöste Hypothesenprüfungen und Klärung von Signalwegen in Lebergewebe.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative RNA-Daten für die Entwicklung und Validierung von Assays.
- Analytik: Stellt hochreine RNA sowie robuste Qualitätskennzahlen (A260/A280, RIN, Ct-Werte) für vergleichende Analysen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet histopathologische Merkmale mit transkriptomischen Profilen zur Biomarker-Korrelierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Workflow für die räumliche Transkriptomik in fixierten Gewebemodellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Target-Validierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung und RNA-Extraktion zur Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen zu Lebererkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Kryoschnittechnik, histologischer Färbung und LCM-Gerätebedienung.
- Setzt Zugang zu RNase-freien Einrichtungen und analytischer Infrastruktur zur Beurteilung der RNA-Qualität voraus.
- Erfordert eine standardisierte, interdisziplinäre Harmonisierung der Gewebeprozessierung und RNA-Extraktionsprotokolle.
- Kann eine Anpassung für andere Gewebetypen oder Krankheitsmodelle unter Validierung erfordern.
- Die RNA-Integrität ist durch die PFA-Fixierung grundsätzlich begrenzt, bleibt jedoch für qPCR und RNA-seq geeignet.
