Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse
April 17th, 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.
Unsere Forschung untersucht hauptsächlich die hepatozytenbezogene Pathophysiologie im Kontext chronischer Lebererkrankungen. Dieses Protokoll ermöglicht die Zellisolierung in Lebergewebeschnitten und die RNA-Extraktion. Im Gegensatz zu FFPE, Paraformaldehyd-fixierten oder CT-Protokollen konservieren und itegratiert, was präzise Mikrodiskussionen und hochwertige Proben für die nachgelagerte OMI-Analyse ermöglicht.
Um zu beginnen, belichte die Stiftmembranfolien ultraviolettem Licht in vier 30 Minuten. Beschichten Sie die Objektträger mit 0,1 Milligramm Poly-L-Lysin pro Milliliter und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Versiegeln Sie die Kanten jedes Schlittens mit einem neutralen Befestigungsmedium.
Mit einem RNase-Dekontaminationsmittel werden alle zugänglichen Oberflächen des Kryostats und alle Werkzeuge gewischt. Ich benutze 75 % Ethanol. Reinige die Bürste und die Werkzeuge gründlich.
Stellen Sie nun die Temperatur des Kryostatens auf minus 20 Grad Celsius ein und lassen Sie sich stabilisieren. Entnehmen Sie die Leberproben aus der Lagerung von minus 80 Grad Celsius. Legen Sie die Proben mindestens 15 Minuten lang in die Kryostatkammer, um das Gleichgewicht zu erreichen.
Tragen Sie eine zwei bis drei Millimeter dicke Schicht OCT-Verbindung auf die Probephase auf. Dann wird die Probestufe auf ein schnelles freies Regal oder in die Kryostatkammer gelegt, um die Verbindungsschicht vorab zu verfestigen. Nachdem Sie eine kleine Menge OCT-Verbindung auf die vorgefestigte Schicht aufgetragen haben, legen Sie den ausgeglichenen Gewebeblock horizontal auf die Verbindung und halten Sie ihn 10 bis 15 Sekunden lang an Ort und Stelle.
Dann montieren Sie die Probenstufe mit dem befestigten Gewebeblock auf den Kopf des Kryostaten. Jetzt stecken Sie die Klinge vorsichtig zwischen die Klemmplatten und Rückplatten von einer Seite des Kryostat. Klemme den Klemmhebel, um die Klinge zu sichern.
Stellen Sie die Kryostatdicke auf 10 Mikrometer ein. Schneiden Sie das Gewebe in Abschnitte und montieren Sie sie direkt auf die vorbehandelten Stiftmembranen im Inneren der Kryostatkammer, die bei minus 20 Grad Celsius gehalten werden. Tauen Sie die Objektträger 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur auf.
Wasche die Folien dreimal mit RN ACE Free PBS vier 10 Sekunden pro Waschen. Gib die gefilterte Mayer-Hämatoxylin-Lösung fünf bis zehn Sekunden lang auf die Gewebeabschnitte. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal mit Ribonuklease-freiem Wasser für jeweils 10 Sekunden, um die restlichen Hämatoxylin zu entfernen.
Beurteilen Sie die Färbungsqualität unter dem Mikroskop. Mit saugfähigem Papier tupfen Sie die Objektträger trocken und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen. Wischen Sie die Labortischoberfläche mit dem RNase-Dekontaminationsmittel ab.
Schalten Sie den Controller ein und lassen Sie das Mikroskop die Initialisierung abschließen. Drehen Sie den Schlüssel im Uhrzeigersinn von der aus- zur ein-Position, um das Lasersystem zu starten. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Laseraufnahme-Mikrodissektionssoftware.
Dann warten Sie, bis die Initialisierung abgeschlossen ist. Führen Sie nun ein steriles 0,2-Milliliter-PCR-Rohr in das Sammelgerät. Mit einer Pipette geben Sie 10 Mikroliter Protease-K-Verdauungspuffer an die Kappe des PCR-Rohrs.
Laden Sie das Sammelgerät in den Halter der Mikroskopprobe. Im Fenster für das Änderungssammler-Gerät. Gehe zum Referenzpunkt anpassen, stelle den Kamerafokus an, um den Referenzpunkt klar zu sehen, und benutze die Pfeilregler, um ihn bei Bedarf zu zentrieren.
Laden Sie einen Gewebeschnitt in den Probenhalter, wobei das Gewebe nach unten zeigt und das Etikett rechts liegt. Wählen Sie die 10-fache Objektivlinse und identifizieren Sie Interessengebiete mit spezifischen pathologischen Merkmalen. Navigiere zum Lasermenü.
Klicken Sie auf Kalibrieren, wählen Sie Ja und schließen Sie die Kalibrierung ab. Im Laserbedienfeld stellen Sie die Laserleistung auf 50, die Blende auf fünf und die Geschwindigkeit auf neun ein. Dann verwenden Sie die grafische Symbolleiste, um einen Kreis um den Zielbereich zu zeichnen.
Wählen Sie eine einzelne Form, drücken Sie auf Start Cut, um eine Laseraufnahme-Mikrodissektion durchzuführen, und positionieren Sie das Sammelgerät, um das dissektionierte Gewebe zu sammeln. Um die Dokumentation zu erfassen, wählen Sie Bilder aus und wählen Sie Bilder speichern, um Vorher- und Nachherbilder im bevorzugten Format zu speichern. Nachdem Sie die gewünschten Zellen gesammelt haben, klicken Sie auf Entladen, um den Kollektor aus der Stufe zu entfernen.
Überprüfen Sie, dass 10 Mikroliter Protease-K-Verdauungspuffer im Deckel verbleiben, und füllen Sie es bei Bedarf wieder auf. Schließe das Rohr und wirbel es gründlich vortex. Dann drehen Sie das Rohr kurz in einer Zentrifuge.
Lagere das Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Extraktion. Der mit Hämatoxylin gefärbte Leberabschnitt auf dem Stift-Objektträger wurde vor und nach der Laser-Capture-Mikrodissektion unter dem Mikroskop visualisiert. Interessensgebiete mit mikrovesikulärer Steatose wurden präzise in die Kappe des A-PCR-Rohrs gesammelt.
Bewahrung intakter zellulärer Morphologie. Die gesamte Ribonukleinsäure, die aus etwa 1000 und 2000 isolierten Laser-Capture-Mikrodissektionszellen extrahiert wurde, ergab jeweils 110,7 Nanogramm bzw. 213,3 Nanogramm. Alle Proben zeigten eine hohe Reinheit mit Absorptionsverhältnissen von 260 mal 280 Nanometern zwischen 1,9 und 2,1.
Die Gelelektrophorese zeigte deutliche 28-s- und 18-s-Ribosom-Ribo-Nukleinsäurebänder. Bioanalysatorprofile von Ribonukleinsäure aus so wenigen wie 1000 Zellen. Gab eine Ribonukleinsäure-Integritätszahl von 6,7 an.
Q-R-T-P-C-R für das Housekeeping-Gen Beta-Aktin ergab Zyklus-Schwellenwerte von 17 bis 19. Die Bewertung der Sequenzierungen durch Bioanalysatoren, die aus 50 Nanogramm der gesamten Ribonukleinsäure konstruiert wurden, zeigte einen charakteristischen Peak zwischen 300 und 500 Basenpaaren. Die RNA-Sequenzierung dieser Bibliotheken lieferte hochwertige Daten mit sowohl Q20- als auch Q30-Werten, die über 90 % und eine niedrige Fehlerquote bei den Replikaten erzielten.
Ein wichtiger Aspekt ist die Verhinderung von Abbauschutz durch Kontrollstopp, schnelle Färbung und gerade Bedingungen durch unsere Verarbeitung. Ordnet man dieses Verfahren, kann es für Echtzeit-PCR und eine Sequenzierung mit fragmentierungsoptimierten Bibliotheksschlüsseln verwendet werden. Etabliert in Leberproben.
Dieses Protokoll ermöglicht das Profilieren von Hepatozyten-Subgruppen und unterstützt pathologieorientierte Hepatologieforschung.
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Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
