Ein Protokoll zur Entnahme von Einzelzell-Suspension aus Maushornhäuten
3. April 2026
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus ganzen Maushornhäuten durch sequentielle Verdauung mit Kollagenase A und Trypsin. Diese Methode liefert lebensfähige Einzelzellen mit hoher RNA-Integrität, wodurch sie mit nachgelagerten Anwendungen wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung und FlowzytometrieY kompatibel sind.
Dieses Protokoll führt in erster Linie eine Methode ein, um hochwertige Einzelzellen aus intakten Maushornhäuten zu gewinnen. Unsere Methode ist lebensfähige Einzelzellen mit hoher RNA-Integrität, was sie mit nachgelagerten Anwendungen wie Einzelzellen auf dickem, dünnem und Flow-Diametrie kompatibel macht. Zunächst legen Sie eine sechs bis acht Wochen alte, eingeschläferte weibliche C57BL6-Maus auf einen sterilen Sektionstisch.
Nachdem Sie die geschlossenen Augenlider mit PBS gespült haben, verwenden Sie eine Augenschere, um einen Schnitt entlang des hinteren Pols des Augapfels zu machen, und legen Sie das isolierte Auge vorsichtig in eine Petrischale mit eiskaltem hormonellem Epithelmedium. Nach dreimagem Ausspülen des Augapfels mit 1XPBS und 5 % Penicillin-Streptomycin verwenden Sie eine Augenschere und -pinzette, um einen Schnitt vom hinteren Pol hin zur Hornhautlimbus zu machen. Lösen Sie vorsichtig die Hornhaut von der Sklera und der Bindehaut entlang des Limbalrandes und entfernen Sie dann mit zwei Paar Zangen die Linse und die Iris vollständig.
Nachdem Sie das Hornhautgewebe dreimal mit PBS gewaschen haben, überführen Sie das saubere Gewebe in einen neuen Schlauch. Fügen Sie eine Milliliter von fünf Milligramm pro Milliliter Kollagenase A A hinzu und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Augenschere in Fragmente von etwa 0,5 mal 0,5 Millimetern. Inkubieren Sie das Röhrchen mit den Hornhautfragmenten mit einer Kollagenase A-Lösung in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Untersuchen Sie das Gewebe alle 10 Minuten während der Verdauung. Wenn keine großen Gewebefragmente mehr übrig sind, zentrifugieren Sie die Probe bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann vorsichtig den Supernatanten. Anschließend wird das Pellet in 200 Mikrolitern 0,25%-Trypsin-EDTA-Lösung wieder suspendiert.
Setzen Sie das Röhrchen für 10 Minuten in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Zellkulturinkubator, um verbleibende Gewebefragmente zu verdauen. Schließlich verwenden Sie eine P1000-Pipette mit einer breiten Bohrungsspitze, um das Gemisch sanft zu triturieren und so eine einzellige Suspension zu erhalten. Zentrifugiere die Zellsuspension wie zuvor demonstriert und suspendiere das Zellpellet in PBS mit 0,04 % BSA neu.
Bei der Zählung der isolierten Hornhautzellen mit einem Hämozytometer wurde festgestellt, dass insgesamt 1,05 mal 10 pro Zellleistung von fünf Stellen aus acht Hornhäuten mit einer durchschnittlichen Zelllebensfähigkeit von 94,6 % und einem Einzelzellverhältnis von über 96,3 % erhalten wurden, was die Suspension für nachgelagerte Anwendungen bestätigte. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass die Zellsuspension 83,5 % pan-CK-positive Epithelzellen, 13,5 % keratokan-positive stromale Zellen und etwa 3 % negative Zellen für beide Marker umfasste. Die aus der Einzelzellsuspension extrahierte RNA zeigte eine hohe RNA-Integritätszahl von etwa 8,8 und ein ribosomales RNA-Verhältnis von 28S mal 18S von etwa 2,15, was eine ausgezeichnete RNA-Qualität bestätigt.
Nach der Gewinnung einzelner Zellen können wir die Funktion der Hornhautzellen und die Erforschung der Oberflächenmarkierungen charakterisieren. In diesem Bereich wird die Zell-zu-Zell-Interaktionen untersucht. Eine Herausforderung bei dieser Methode besteht darin, die Hornhaut praktisch von anderen Geweben zu trennen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen aus gesamten Maus-Corneae vorgestellt. Die Methode kombiniert eine präzise Gewebedissektion mit einer sequenziellen enzymatischen Verdauung und ermöglicht die Herstellung lebensfähiger Einzelzellen, die für nachgeschaltete Anwendungen wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und die Durchflusszytometrie geeignet sind. Das Protokoll liefert hohe Zellzahlen, hervorragende Vitalität und erhält die RNA-Integrität aufrecht, wodurch eine detaillierte Analyse der zellulären Heterogenität der Cornea ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Ophthalmologie
- Zellbiologie
- Einzelzell-Analyse
Hintergrund
- Die Hornhaut ist die äußerste Schicht des Auges und für das Sehen sowie die Homöostase der Okularoberfläche unerlässlich.
- Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) erfordert hochwertige Einzelzell-Suspensionen.
- Hornhautgewebe ist dicht und komplex, was die Zell-Dissociation erschwert.
- Bereits bestehende Protokolle liefern oft eine geringe Zellviabilität oder schlechte RNA-Qualität.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus intakten Maus-Corneae.
- Sicherstellung einer hohen Zellviabilität und RNA-Integrität für nachgeschaltete Anwendungen.
- Möglichmachung der genauen Identifizierung und Quantifizierung der wichtigsten Hornhautzelltypen.
Verwendete Methoden
- Präparation von Hornhäuten aus euthanasierten C57BL6-Mäusen.
- Sequenzielle enzymatische Verdauung mit Kollagenase A und Trypsin-EDTA.
- Mechanische Zerkleinerung und sanftes Triturieren zur Herstellung einer Einzelzell-Suspension.
- Bestimmung der Zellviabilität mittels Trypanblau-Färbung und Zählung mit einem Hämozytometer.
- Immunfluoreszenzfärbung für Pancytokeratin (epitheliale Zellen) und Keratocan (stromale Zellen).
- RNA-Integritätsanalyse mittels Bioanalyzer.
Hauptergebnisse
- Erhielt etwa 1,05 × 105 Zellen aus acht Hornhäuten.
- Hohe Zellviabilität (94,6 %) und Einzelzellanteil (96,3 %).
- Zellzusammensetzung: 83,5 % pan-CK-positive epitheliale Zellen, 13,5 % keratocan-positive stromale Zellen, ca. 3 % negativ für beide Marker.
- RNA-Integritätszahl (RIN) von ca. 8,8 und 28S/18S-rRNA-Verhältnis von ca. 2,15, was auf eine hervorragende RNA-Qualität hinweist.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll erzeugt zuverlässig hochwertige Einzelzell-Suspensionen aus Maus-Korneen.
- Die Zellpräparationen eignen sich für anspruchsvolle nachgeschaltete Anwendungen, einschließlich der scRNA-seq.
- Diese Methode ermöglicht detaillierte Untersuchungen der Funktionen von Hornhautzellen und der Interaktionen zwischen Zellen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Hochwertige Einzelzell-Suspensionen aus Maus-Corneae sind entscheidend, um die entdeckungsorientierte Augenforschung voranzutreiben und eine hochauflösende zelluläre Profilierung zu ermöglichen. Dieses Protokoll behebt einen kritischen Engpass bei der Herstellung lebensfähiger, RNA-intakter Einzelzellen aus dichtem okularem Gewebe, was die Zuverlässigkeit nachgeschalteter Einzelzell-Analysen direkt beeinflusst. Eine robuste Zellpräparation erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Target-Validierung und unterstützt die translationale Kontinuität zwischen Entdeckungs- und präklinischen Abläufen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der zellulären Heterogenität der Hornhaut mit Einzelzell-Auflösung.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Targetstrukturen, da die Zellviabilität und die RNA-Integrität erhalten bleiben.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung durch eine genaue Identifizierung der Zelltypen.
- Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Auswahl von ophthalmologischen Targetstrukturen in frühen Entwicklungsstadien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte Einzelzell-Suspensionen mit hoher Vitalität für die Assay-Entwicklung.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und quantitative Auswertung für nachgeschaltete Einzelzell-RNA-Sequenzierungen.
- Bereitet validiertes biologisches Material für skalierbare Screening-Workflows auf.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkstoffeffekte auf unterschiedliche Hornhautzellpopulationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt mit krankheitsrelevanten Modellen überein, da die natürliche Vielfalt der Hornhautzellen erhalten bleibt.
- Erhält die RNA-Qualität für die Entdeckung und Validierung translationsrelevanter Biomarker.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem eine Datenkontinuität von der Entdeckungsphase bis zu präklinischen Stadien sichergestellt wird.
- Reduziert biologische Unschärfen in präklinischen ophthalmologischen Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und präklinischer Forschung und ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Gewebe-Dissociation zur Einzelzell-Analyse sowie nachgeschalteten funktionellen Untersuchungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch hochpräzise Einzelzell-Profilierung.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, quantitative Einzelzell-Suspensionen für die Bereitschaft zu Assays und die Untersuchung von Wirkstoffen.
- Analytik: Liefert robuste Metriken zur Zellviabilität, Quantifizierung von Zelltypen und RNA-Integrität für den vergleichenden Ansatz.
- Translationale Forschung: Erhält die zelluläre Diversität und RNA-Qualität zur Abstimmung von Biomarkern und präklinischer Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Protokollablauf, der für verschiedene augenheilkundliche Forschungsprogramme anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert die mechanistische Mehrdeutigkeit bei der Target-Validierung.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Einzelzellpräparationen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in der ophthalmologischen Forschung und Entwicklung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets im Entdeckungsstadium.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der mikrochirurgischen Dissektion von okularem Gewebe und enzymatischen Verdauungsverfahren.
- Benötigt Zugang zu Assays zur Zellviabilitätsbestimmung sowie zur Immunfluoreszenz- und RNA-Integritätsanalyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Kann durch Optimierung des Protokolls auf andere dichte Gewebetypen übertragen werden.
- Die präzise Trennung des Gewebes ist entscheidend, um Kontaminationen zu vermeiden und die Probeneinheitlichkeit sicherzustellen.
