Hepatitis-E-Virus-Fluoreszenzreduktions-Neutralisationstest zur Messung neutralisierender Antikörper-Titer

Der Hauptzweck des fluoreszenzreduktionsbasierten Neutralisationstests ist es, das Neutralisierungspotenzial eines Impfstoffkandidaten und Antikörper gegen HEV zu quantifizieren. Die bekannte zytopathische Natur von HEV begrenzt den PRND-Test. Dieses Protokoll konzentriert sich auf immunbasiertes Training von PRND, um infizierte Zellen zu visualisieren und später zu beminen – Um zu beginnen, zählen Sie die frisch gespaltenen HuH-7-Zellen.

Dann wird ein mikroskopisch hochwertiger Glasdeckel in eine 12-Bohrloch-Platte gelegt und 0,2 Millionen Zellen pro Bohrung in einem Milliliter vollständigen DMEM mit 10 % FBS ausgesät. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag fügen Sie 500 Mikroliter, serumfreies Medien, das 1,8 mal 10 enthält, zu der Potenz von vier Genomkopien gereinigtes G1-HEV zu den gesamenten Zellen.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für eine Stunde. Verwenden Sie 500 Mikroliter DPBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Füge zwei Milliliter DMEM mit 2 % FBS in die Brunnen hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 500 Mikrolitern DPBS und inkubieren Sie zwischen jedem Waschen fünf Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie den Zellen 500 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd hinzu und inkubieren Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend werden die Zellen wie zuvor gezeigt mit DPBS gewaschen. Nach der letzten Wäsche werden sie 30 Minuten in DPBS bei Zimmertemperatur inkubiert. Fügen Sie 250 Mikroliter Blocklösung mit 5 % normalem Ziegenserum, 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,3 % Triton X100 in DPBS hinzu.

Eine Stunde lang in einem Shaker bei Zimmertemperatur inkubieren. Entferne die Blocklösung und wasche einmal mit 500 Mikrolitern DPBS. Dann geben Sie 250 Mikroliter primäre Antikörperlösung mit einer Verdünnung von eins bis 500 Prozent.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag werden die Zellen dreimal mit DPBS gewaschen, wie zuvor gezeigt. Fügen Sie 100 Mikroliter sekundären Antikörper bei einer Eins-zu-1.000-Verdünnung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur in einer humifizéierten Kammer.

Führen Sie den Wasch-Inkubationszyklus wie zuvor gezeigt durch. Gib 10 Mikroliter Antifade-Reagenz mit DAPI auf einen Glasträger. Befestigen Sie den Deckel mit Zellen, die dem Reagenz zugewandt sind, und vermeiden Sie dabei Luftblasen.

Versiegeln Sie den Deckmantel mit Nagellack, um ihn für die konfokale Mikroskopie-Visualisierung zu erhalten. Zähle frisch gespaltene HuH-7-Zellen. Dann wird ein mikroskopischer Glasdeckel in eine 12-Well-Platte gelegt und 0,2 Millionen Zellen in einem Milliliter kompletten DMEM pro Bohrung ausgesaat.

Am nächsten Tag bereiten Sie eine zehnfache Serienverdünnung der Anti-ORF2- und Kaninchen-Immunglobulin-G-Antikörper in serumfreiem Medium vor, mit einer Anfangsantikörperkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter und bis zu einer Endverdünnung von 10 Potenz minus fünf. Das Endvolumen der Verdünnung sollte 100 Mikroliter betragen. Dann addiert man 1,8 mal 10 zur Potenz von vier Genomkopien gereinigten G1-HEV zu jeder Antikörperverdünnung.

Inkubieren Sie die Antikörper-Virusmischung bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für eine Stunde. Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern DPBS. Gib die Antikörpervirenmischung zu den Zellen.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für eine Stunde. Wasche die Zellen mit 500 Mikrolitern Puffer. Nach der Zugabe von DMEM mit 2 % FBS inkubieren Sie 72 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Verarbeiten Sie die Zellen für eine immunfluoreszente Färbung, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie die Fluoreszenzbilder aufgenommen haben, öffnen Sie die ImageJ-Software. Wählen Sie Datei aus und öffnen Sie das Bild.

Wählen Sie dann Bild, Typ und klicken Sie auf 8-Bit, um das RGB-Bild in 8-Bit-Format umzuwandeln. Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie Bild auswählen und dann Anpassen auswählen, dann Schwellenwert, wobei Sie die untere Ebene auf 40 und die obere auf 255 setzen. Wählen Sie Analysieren, wählen Sie Partikel analysieren und aktivieren Sie Ergebnisse anzeigen, Ergebnisse löschen, zusammenfassen, an Kanten ausschließen und Zusammengesetzte interessierende Bereiche.

Klicken Sie dann auf OK, um die Zahl der fluoreszierenden Flecken zu erhalten. Berechnen Sie prozentuale Neutralisierung und NT50 als Antilog von Log10 NT50 unter Verwendung der angegebenen Formel. Zeichnen Sie das Diagramm dar, das Mittelwert und Standardabweichung aller Felder zeigt.

Ein signifikanter Anteil an G1-HEV-Ribonukleinsäure wurde in infizierten Zellen im Vergleich zu simulierten infizierten Zellen nachgewiesen. Ein Immunfluoreszenz-Test mit Anti-ORF2-Antikörper bestätigte die ORF2-Expression in den infizierten HuH-7-Zellen. Der 50%-Neutralisationstiter des Anti-ORF2-Antikörpers wurde auf 2,1 mal 10 x drei geschätzt.

Repräsentative Bilder zeigen das Erscheinungsbild von simuliert infizierten und g1-HEV-infizierten HuH-7-Zellen im Test zur Neutralisierung der Fluoreszenzreduktion. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, das Neutralisationspotenzial von Anti-HEV-Antikörpern zu untersuchen und ihren 50%-Neutralisationstiter zu messen. Der entscheidende Schritt dieses Protokolls ist die Isolierung des infektiösen Hepatitis-E-Virus sowie die ordnungsgemäße Zellfärbung und Aufnahme hochauflösender Bilder.

Alternative Methoden wie RT-qPCR und ELISA können zur Bestimmung des Neutralisationstiters verwendet werden, haben jedoch einige Einschränkungen.