Name: Ein-Kanal-Elektrophysiologie unter Verwendung eines miniaturisierten Montal-Mueller-Planar-Lipid-Doppelschicht-Systems zur Aufzeichnung eines synthetischen K2P-Kanals (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Einzelkanal-Elektrophysiologie mit einer miniaturisierten Montal-Mueller-Planar-Lipid-Doppelschicht-Plattform durchführen. Diese Methode reduziert Reagenzienverbrauch und vereinfacht die Analyse von Ionenkanälen wie ancTREK1.

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Wir danken Sofia Diletta Guzzeloni für ihre Unterstützung bei der Zelltransfektion. Wir danken den Mitarbeitern von Elements, Dr. Leon Juarez und Dr. Michelangelo Paci. Diese Arbeit wurde vom Department of Molecular Medicine der Universität Pavia, Italien, im Rahmen der Initiative Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), von der Cariplo-Stiftung (#2019-1809) und vom PNRR-Forschungsprogramm CN00000013 „National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing“ für M.L. unterstützt.

F.T. und A.P. sind der CEO bzw. ein Angestellter von Elements S.r.l. Alle anderen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

In dieser Studie verwendeten wir die PLB-Technik, um die elektrophysiologischen Eigenschaften eines synthetischen K2P-Kanals auf Ebene einzelner Moleküle zu untersuchen. Unter den verschiedenen in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen planaren Lipidmodellen konzentrierten wir uns auf die Bildung von BLMs, die über eine Öffnung mit einem Durchmesser zwischen 50 und 140 µm aufgezogen werden, die in einer vertikalen, unpolaren Oberfläche angebracht ist und zwei wässrige Kompartimente voneinander trennt. Diese Konfiguration ermöglicht die Nachbildung der Zellmembranumgebung, während gleichzeitig die Kontrolle über experimentelle Parameter wie die Herstellung der Lipidmembran und die Zusammensetzung des Elektrolyten (z. B. Ionenstärke und pH) gewahrt bleibt3. Wir stellten die BLMs mit der Montal–Mueller-(Faltungs-)Methode5 wieder her, bei der sich die Membran spontan bildet, wenn zwei zuvor an der Luft-Wasser-Grenzfläche der beiden wässrigen Lösungen ausgebreitete Lipidmonolagen durch Anheben des Wasserspiegels über der Öffnung miteinander verbinden.
Das hier vorgestellte Protokoll zur Membranbildung ist äußerst intuitiv; jedoch beeinflussen mehrere kritische Schritte den experimentellen Erfolg maßgeblich. Um eine ordnungsgemäße elektrische Verbindung zwischen dem BLMchipMM und dem Verstärker sicherzustellen, ist es unerlässlich, die Chlorierung der Ag/AgCl-Drahtenden, die in die PCB-Stecksockel eingeführt werden, zu vermeiden. Während der Montage des BLMchipMM kann eine unsachgemäße Positionierung der Drähte dazu führen, dass sie mit dem Verstärkergehäuse in Kontakt kommen, was zu Kurzschlüssen und Signalüberlastung führen kann. Ein weiterer kritischer Faktor ist die Vorbehandlung der Öffnung: Übermäßiger Druck beim Auftragen der Vorbehandlungslösung kann die Polyimid-Trennwand beschädigen, während unsachgemäße Handhabung der Elektrolytlösung – insbesondere das Benetzen des Öffnungsbereichs – die Membranbildung beeinträchtigen kann. Darüber hinaus ist eine sorgfältige Reinigung der Messkammer des BLMchipMM für die Reproduzierbarkeit unerlässlich. Die Verwendung von 100 % Isopropanol, gefolgt von gründlichem Spülen und vollständigem Trocknen, stellt sicher, dass Rückstände keine nachfolgenden Experimente stören.
Es sind mehrere Modifikationen des Protokolls möglich. Während die Chlorierung durch Einweichen in Bleichmittel einen praktischen und weit verbreiteten Ansatz darstellt, können auch alternative Methoden wie das Galvanisieren verwendet werden43. Ebenso sind Variationen bei der Vorbehandlung und der Lipidpräparation möglich. Herkömmliche Vorbehandlungslösungen bestehen typischerweise aus langkettigen Alkanen, die in flüchtigen Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln gelöst sind36; obwohl eine 1%ige Hexadecan-Lösung in n-Hexan üblich ist, können auch andere Lösungsmittel geeignet sein. Die Lipidzusammensetzung kann ebenfalls je nach experimentellen Anforderungen angepasst werden. Während DPhPC-Lipide eine optimale Membranstabilität bieten, können alternative Lipidmischungen, einschließlich natürlicher oder synthetischer Zusammensetzungen, verwendet werden36. Ein wesentlicher Vorteil vertikaler Lipiddoppelschichten, die mittels der Faltmethode erzeugt werden, besteht in der Möglichkeit, asymmetrische Membranen herzustellen, bei denen jedes Lipid-Doppelschichtblatt aus unterschiedlichen Lipidarten besteht5,22, eine Eigenschaft, die bekanntermaßen die Funktion von Membranproteinen beeinflusst.
Die Fehlersuche bei der Bildung von Membranen umfasst in der Regel Anpassungen der wässrigen Phasenstände. Wenn sich zunächst keine Membran bildet, kann wiederholtes Absenken und Anheben des Pufferpegels in einem Kompartiment die Bildung der Doppelschicht erleichtern. Falls dies nicht erfolgreich ist, kann das Aufbringen einer Luftblase über die Öffnung die Umverteilung der Lipide und die Membranbildung fördern. Wenn die Bildung weiterhin misslingt, deutet dies in der Regel auf Probleme im Zusammenhang mit der Vorbehandlung oder Kontamination hin; in einem solchen Fall wird empfohlen, die Ableitkammer zu reinigen und das Experiment erneut zu starten.
Die Kernkomponenten dieses Aufbaus bestehen aus dem kompakten Verstärker eNPR 100 kHz und dem BLMchipMM. Der Verstärker ist ein kompaktes, geräuscharmes Spannungs-Klemm-System, das den Einsatz zusätzlicher externer Geräte – wie beispielsweise externer Faraday-Käfige – überflüssig macht, da das Gehäuse des Verstärkers selbst eine wirksame elektromagnetische Abschirmung bietet. Der BLMchipMM ist eine vormontierte, miniaturisierte Ableitungskammer, die mit einer Leiterplatte (PCB) ausgestattet ist und direkt mit dem Verstärker verbunden werden kann. Er besteht aus zwei C-förmigen Kammern, die durch eine Polyimid-Trennwand mit einer konisch gebohrten Öffnung getrennt sind, an der die künstliche Membran gebildet wird. Die reduzierten Abmessungen des Systems, mit Kammerinhalten von etwa 110 µL, verringern den Reagenzienverbrauch erheblich und senken die inhärente Kapazität, wodurch die Signalqualität verbessert wird. Zudem kann das Gerät mehrfach wiederverwendet werden, ohne dass es zerlegt werden muss, sofern geeignete Reinigungsverfahren befolgt werden, was die Variabilität verringert und die experimentelle Reproduzierbarkeit erhöht.
Trotz dieser Vorteile sollten einige Limitationen berücksichtigt werden. Der derzeitige Aufbau beinhaltet keine integrierten Module zur Steuerung von Temperatur, Druck oder Perfusion. Es wurde berichtet, dass die intrinsische Membranspannung mechanosensitive Kanäle wie TREK1 beeinflusst.44,45,46; allerdings ermöglicht der vorliegende Aufbau keine gezielte Steuerung der Membranspannung, und es werden hier keine mechanistischen Schlussfolgerungen gezogen. Insgesamt bietet diese Plattform ein robustes und zugängliches System zur Aufzeichnung der Ionenkanalaktivität in künstlichen Membranen. In dieser Studie untersuchten wir den synthetischen K2P Kanal ancTREK1, ein rechnergestützt abgeleiteter, ursprünglicher Kanal der TREK-Unterfamilie. Die aufgezeichneten Daten zeigen, dass der gereinigte ancTREK1, in PLBs rekonstituiert, Einzelkanal-Verhalten aufweist, das mit den berichteten TREK1-ähnlichen Leitfähigkeits-Eigenschaften übereinstimmt. Unter Mg2+Unter kaliumfreien symmetrischen Bedingungen mit 200 mM Kalium zeigt der Kanal eine messbare Strom-Spannungs-Beziehung mit Amplitudenwerten von etwa 13 pA bei 80 mV und −19 pA bei −80 mV. Zusätzlich weist ancTREK1 den charakteristischen Zustand mit hoher Leitfähigkeit auf, der bei TREK1-Kanälen beobachtet wird, mit höherer Leitfähigkeit bei negativen Potentialen (~205,6 pS) im Vergleich zu positiven Potentialen (~112,8 pS). Bemerkenswerterweise zeigt ancTREK1 einen erhöhten NPo bei positiven Potentialen (0,78 bei 80 mV) und einen verminderten NPo bei negativen Potentialen (0,53 bei −80 mV und 0,28 bei −120 mV), was sich von Beobachtungen in ausgezogenen Patch-Konfigurationen unterscheidet.42Diese Befunde unterstützen die Verwendung dieses Systems für die prinzipielle Aufzeichnung einzelner Kanäle rekonstituierter Membranproteine.

Die Rekonstitution von Ionenkanälen in künstliche Lipiddoppelschichten, auch als schwarze Lipidmembranen (BLMs) bekannt, ist eine etablierte Methode zur elektrophysiologischen Charakterisierung von Ionenkanälen auf Einzelmolekülebene1. Die Vorteile von BLMs ergeben sich aus ihrer Struktur. Tatsächlich wird eine planare Lipiddoppelschicht (PLB) innerhalb einer Pore in einer unpolarer Oberfläche erzeugt, die zwei flüssige Lösungen voneinander trennt. Dadurch ermöglicht sie, ähnlich wie eine biologische Membran, die Aufzeichnung der Ionenkanalaktivität unter hochgradig kontrollierten Bedingungen, einschließlich der Zusammensetzung der Membranlipide sowie der Konzentrationen von Elektrolyten oder chemischen Verbindungen, und bleibt dabei von beiden Seiten zugänglich. Diese Zugänglichkeit erlaubt es zudem, Ionenkanäle direkt einzusetzen, beispielsweise aus einer micellaren Lösung oder durch liposomvermittelte Fusion2,3.
Das erste beschriebene künstliche Membransystem wurde mithilfe der „Maltechnik“4 erzeugt, bei der ein Tropfen Lipide, gelöst in einem nichtflüchtigen organischen Lösungsmittel, mit einem Pinsel auf eine kleine Öffnung aufgetragen wird. Durch das Hinzufügen einer wässrigen Lösung auf beiden Seiten der Öffnung entsteht spontan eine Lipiddoppelschicht. Ein erheblicher Nachteil dieser Methode besteht jedoch in der Rückhaltung von Lösungsmittelresten, die die Eigenschaften der Membran beeinflussen können. Um die Menge an verbleibendem organischem Lösungsmittel in den Lipiddoppelschichten zu verringern, wurde die „Faltmethode“5 entwickelt, die die Bildung „lösungsmittelfreier“ BLMs ermöglicht. Bei diesem Ansatz wird eine Lipidlösung in einem flüchtigen Lösungsmittel auf der Wasseroberfläche ausgebracht, um zwei Monoschichten zu bilden. Durch schrittweises Anheben des Wasserspiegels über der Öffnung falten sich diese Lipidmonoschichten über die Öffnung und bilden so eine Doppelschicht. Obwohl die resultierende BLM als lösungsmittelfrei bezeichnet wird, erfordert eine erfolgreiche Bilayer-Bildung eine Vorbehandlung der Öffnung mit einer dünnen Schicht aus nichtflüchtigem Lösungsmittel. Das zentrale Element für diese Experimente besteht aus einer Messkammer mit zwei wässrigen Kompartimenten (üblicherweise als cis und trans bezeichnet), die durch eine lipophile Trennwand mit einer kleinen Öffnung (50–250 µm Durchmesser) getrennt sind (Abbildung 1). In jedes Kompartiment wird eine Silber/Silberchlorid-(Ag/AgCl-)Elektrode eingeführt. Sobald sie in die Elektrolytlösung eingetaucht sind, stellen diese Elektroden die elektrochemische Verbindung zwischen der Lipiddoppelschicht und der Messapparatur her. Letztere besteht aus einem Spannungs-Klemm-Verstärker, der eine präzise Steuerung des transmembranen Potentials sowie die gleichzeitige Messung der Ionenströme ermöglicht, die durch eingebettete porenbildende Proteine fließen.
<img alt="Schema einer Lipiddoppelschicht-Ionenkanalanordnung; Elektrophysiologie-Setup; Analyse der geschlossenen/offenen Kanalzustände." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Planar-Lipiddoppelschicht-(PLB-)Elektrophysiologie-Setups. Eine schematische Übersicht über die wesentlichen Komponenten, die für PLB-Experimente erforderlich sind. Die Messkammer besteht aus zwei wässrigen Kompartimenten (cis und trans), die durch eine lipophile Trennwand getrennt sind, in der sich eine Öffnung befindet, an der eine Lipiddoppelschicht gebildet wird. Silber/Silberchlorid-(Ag/AgCl-)Elektroden sind in die Elektrolytlösung in jedem Kompartiment eingetaucht. Eine Elektrode appliziert Spannungsreize (z. B. Sinus-, Rechteck- oder Dreiecksignale), während die andere, die auf Massepotential gehalten wird, mit einem Strom-Spannungs-Wandler verbunden ist, der den Ionenstrom in ein proportionales Spannungssignal umwandelt. Das Signal wird verstärkt, optional gefiltert, digitalisiert und zur Echtzeitüberwachung und -analyse aufgezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Es wurden auch andere Methoden zur Bildung von BLMs etabliert. Dazu gehört eine gängige Vorgehensweise, bei der Lipiddoppelschichten auf der Spitze einer Patch-Clamp-Pipette suspendiert werden. Demnach ermöglicht die Tropfspitzen-Methode6 die Bildung einer suspendierten, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschicht auf der Öffnung einer Glas-Mikropipette mit einem Durchmesser von etwa 4 µm, indem die Spitze wiederholt durch eine Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche getaucht wird, wodurch bei jedem Durchgang eine einzelne Lipidschicht erfasst wird. Die Patch-Clamp-Technik wurde ebenfalls für Einzelkanalmessungen in Lipiddoppelschichten verwendet. Beispielsweise wird bei der Ausstanz-Methode7 eine Glaspipette mit einem Durchmesser zwischen 10 und 80 µm verwendet, um eine große Membran abzudecken, die ursprünglich über eine Öffnung in einer Messkammer aufgetragen wurde. Alternativ beinhaltet die Liposom-Patch-Methode die Verwendung eines vorgebildeten nano- bis mikrometergroßen Vesikels als lösungsmittelfreie BLM8,9. Insbesondere wurden riesige unilamellare Vesikel häufig für Einzelkanalaufnahmen mittels verschiedener Patch-Clamp-Konfigurationen verwendet, einschließlich der zellangehefteten und der ausgeschnittenen Patch-Modi10,11.
Mehrere Plattformen haben sich ebenfalls für die parallele und automatisierte Bildung mehrerer Doppelschichten entwickelt. Ein solcher Ansatz ist die Tropfen-Grenzflächen-Doppelschicht-(DIB-)Technik12, bei der wässrige Tropfen in eine Lipid-Lösungsmittel-Mischung gebracht werden. Bei dieser Methode bilden Lipid-Monolagen spontan eine Hülle um die Tropfen, und die Bildung einer Doppelschicht erfolgt, wenn zwei Tropfen in Kontakt kommen. In einigen Aufbauten können DIBs auf Hydrogelen erzeugt werden, um die Membranstabilität zu verbessern13. Ein alternativer Ansatz, der auf der DIB-Bildung an der Spitze einer Glaspipette basiert, ist die Kontakt-Blasen-Doppelschicht-(CBB-)Methode14, bei der wässrige Blasen mithilfe zweier Mikropipetten in eine Ölphase eingeführt werden. Wie beim DIB-Ansatz bildet sich spontan eine Lipiddoppelschicht, wenn zwei mit Lipid beschichtete Blasen in Kontakt gebracht werden. Eine weitere Plattform stellen angeordnete BLM-Systeme dar, die aus Arrays wohldefinierter mikro- bis nanoskaliger Poren in Gitteranordnung bestehen. In diesen Systemen können suspendierte Lipiddoppelschichten entweder manuell – durch Techniken wie das Auftragen oder Falten beziehungsweise durch Liposomen-Vesikelbruch15,16,17 – oder automatisch durch sequenzielle Injektion von Lipid- und Pufferlösungen bei Kopplung mit mikrofluidischen Kanalstrukturen18,19 gebildet werden.
Obwohl zahlreiche Methoden zur Herstellung lösungsmittelfreier BLMs entwickelt wurden, konzentrieren wir uns in dieser Arbeit auf die Faltmethode, die in einer miniaturisierten und integrierten Plattform implementiert ist, um das Einzelkanalverhalten von in einer künstlichen Lipiddoppelschicht eingebetteten Membranproteinen zu untersuchen. Die Experimente wurden mit dem Elements-System durchgeführt, das aus zwei Komponenten besteht: dem Elements Nanopore Reader (eNPR-Verstärker) und dem BLMchipMM (Abbildung 2A und Abbildung 2B). Ersteres ist ein kompakter, rauscharmer Spannungs-Klemm-Verstärker, der den Arbeitsplatz vereinfacht, indem er eine vollständige und unabhängige Einheit bildet und somit zusätzliche externe Geräte überflüssig macht. Der BLMchipMM ist ein vormontiertes, miniaturisiertes System, das für die Montal-Mueller-Technik konzipiert ist und als experimentelle Schnittstelle dient. Er besteht aus einer transparenten Aufzeichnungskammer aus Polymethylmethacrylat (PMMA), die mit einer Leiterplatte (PCB) verbunden ist und zwei Buchsen enthält, die für Ag/AgCl-Drahtelektroden vorgesehen sind und eine direkte Verbindung zum Verstärker ermöglichen. Die Kernstruktur der Kammer besteht aus einem zwischen zwei transparenten PMMA-Komponenten abgedichteten Polyimid-Trennstück. Das Trennstück ist 50 µm dick, mit Ausnahme eines kleinen zentralen Bereichs (3,78 mm2), in dem die Dicke auf 25 µm reduziert ist, um die Bildung der Doppelschicht zu erleichtern. In der Mitte dieses dünneren Bereichs wird durch Laserbohren eine konisch zulaufende Öffnung erzeugt, wodurch die mechanische Stabilität der Lipiddoppelschicht erhöht wird20,21. Vier Öffnungsdurchmesser (50, 75, 100 und 140 µm) sind verfügbar, was eine Anpassung der Membrankapazität ermöglicht (Tabelle 1). Jede PMMA-Komponente weist einen C-förmigen Hohlraum mit einem Volumen von 110 µL auf und bildet so zwei fluiddichte Kompartimente auf beiden Seiten des Polyimid-Trennstücks, um die Elektrolytlösung aufzunehmen. In jeden PMMA-Block sind auf gegenüberliegenden Seiten zwei schräg verlaufende Fluidkanäle gebohrt: Ein Kanal dient zum Einsetzen der Ag/AgCl-Elektrode, während der andere eine manuelle Anpassung des Pufferpegels im Reservoir mittels Pipettieren ermöglicht.
<img alt="Mikrofluidisches Gerät mit modularen Kammern; Schema zeigt PMMA-Seite, Elektroden, Leiterplatte zur Analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Integriertes Elements Nanopore Reader- und BLMchipMM-System. (A) Fotografie, die den in den dafür vorgesehenen Schlitz des Elements Nanopore Reader (eNPR)-Verstärkers eingefügten BLMchipMM zeigt. (B) Schematische Darstellung der BLMchipMM-Bauteile, einschließlich der Polymethylmethacrylat (PMMA)-Aufzeichnungskammer, der Polyimid-Trennwand mit mikroskaliger Öffnung und der Leiterplatte (PCB) mit Sockeln für Ag/AgCl-Elektroden sowie einem Schlitz zur Kammerausrichtung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lochdurchmesser (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lochdicke (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typische Membrankapazität (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Merkmale der verfügbaren BLMchipMM-Aperturformate. Lochdurchmesser, Septumdicke im Aperturbereich und typische Werte der Membrankapazität für BLMchipMM-Geräte mit 50, 75, 100 und 140 µm großen Aperturen. Die Werte der Membrankapazität gelten für Doppelschichten, die aus 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin-Lipiden gebildet wurden.
Üblicherweise sind die in Laboren verwendeten Messkammern entweder selbstgebaute Vorrichtungen oder kommerziell erhältliche Geräte. Im ersten Fall erfordert der Aufbau des Systems die Zusammenfügung verschiedener Komponenten und die Entwicklung einer zuverlässigen Methode, um die Öffnung in der Membran zu erzeugen, was den Zugang für viele Labore erschweren kann. Selbst bei Verwendung kommerzieller Geräte ist häufig vor jedem Experiment eine manuelle Integration mehrerer Komponenten erforderlich. Im Gegensatz dazu ist der BLMchipMM vormontiert und muss zwischen Experimenten zur routinemäßigen Reinigung nicht demontiert werden. Derselbe Apparat kann gewaschen und für mehrere Experimente wiederverwendet werden, ohne dass die Qualität der Membranbildung beeinträchtigt wird, sofern die verwendeten Lösungsmittel mit den Materialien des Geräts verträglich sind. Dadurch werden nutzerabhängige Variabilitäten verringert und das Risiko von Leckagen, die mit manuell angebrachten Dichtelementen verbunden sind, minimiert. Die Verwendung externer, austauschbarer und regenerierbarer Silberdraht-Elektroden verlängert zudem die Nutzungsdauer des Systems, insbesondere unter experimentellen Bedingungen, die den Elektrodenverbrauch beschleunigen.
Darüber hinaus weisen selbstgebaute Vorrichtungen oft große Kompartimentvolumina auf, wodurch die Menge an biologischen und chemischen Komponenten, die für Experimente erforderlich ist, zunimmt. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Miniaturisierung des BLMchipMM die Verringerung der experimentellen Volumina und reduziert somit den Verbrauch an Reagenzien, Proteinen und anderen Verbindungen erheblich. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Arbeit mit schwer zu exprimierenden oder geringer Ausbeute liefernden Membranproteinen oder wenn die hohen Kosten für die Synthese von Testverbindungen die Gesamtkosten der Experimente erhöhen. Wichtig ist, dass der BLMchipMM die Bildung von lösungsmittelminimierten Doppelschichten ermöglicht und asymmetrische Membrankonfigurationen unterstützt, bei denen jedes Blatt aus unterschiedlichen Lipidarten bestehen kann5,22, wodurch die Untersuchung der Funktion von Membranproteinen unter kontrollierten Bedingungen erleichtert wird.
Traditionell werden Strommessungen mithilfe von Verstärkern durchgeführt, die für Patch-Clamp-Experimente konzipiert sind und häufig eine Verbindung zu einem separaten Digitalisierer für die Datenaufnahme sowie Steuerung über grafische Schnittstellen erfordern. Diese Systeme sind nicht nur sperrig und teuer, sondern beinhalten oft auch nicht intuitive Einrichtungsverfahren für Anwender ohne Spezialkenntnisse. Zudem ist aufgrund der Größe der Ableitungskammer und des Designs herkömmlicher Verstärker – die in der Regel keinen integrierten Schutz der Kopfstufen-Eingänge gegen elektrostatische Störungen bieten – häufig die Verwendung eines externen Faraday-Käfigs erforderlich. Die Qualität und Erdung eines solchen Käfigs kann die Rauschleistung des Systems erheblich beeinflussen. Der BLMchipMM vereinfacht diese Konfiguration, wenn er zusammen mit einem kompakten, integrierten Verstärker verwendet wird, da er die Notwendigkeit externer Komponenten verringert. Die Signal-Digitalisierung erfolgt innerhalb des Geräts, und das Gehäuse des Systems bietet eine Abschirmung, die die Anfälligkeit gegenüber elektromagnetischen Umgebungsstörungen reduziert.
Um die Anwendbarkeit dieser Plattform zu demonstrieren, wurde der K2P-ähnliche Kanal ancTREK1, ein rechnerisch abgeleitetes, ursprüngliches Mitglied der TREK-Unterfamilie (ergänzende Abbildung 1), als Testprotein verwendet, um eine erfolgreiche Rekonstitution und Einzelkanalaufzeichnung zu validieren. K2P-Kanäle bilden dimere Kaliumleckkanäle, die das Ruhe-Membranpotenzial und die zelluläre Erregbarkeit regulieren, wobei die TREK-Kanäle eine gut charakterisierte Unterfamilie darstellen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Bildung künstlicher Lipiddoppelschichten</td></tr><tr><td>2-Propanol (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Reinigung des BLMchipMM-Geräts</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Herstellung von Agarosegelen</td></tr><tr><td>Horizontales Agarosegelelektrophorese-System</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Trennung von DNA-Fragmenten</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Selektion transformierter Bakterien</td></tr><tr><td>Anti-GFP-Nanobody-Sepharose-Harz (hausgemacht)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Affinitätsreinigung von GFP-markierten Proteinen</td></tr><tr><td>Anza-Alkalische Phosphatase</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Dephosphorylierung von Vektoren</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Restriktionsverdau</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Restriktionsverdau</td></tr><tr><td>Anza Red Puffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Restriktionsverdaupuffer</td></tr><tr><td>Aprotinin-Proteaseinhibitor</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Verhinderung des Proteinabbaus</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Zellpelletierung und Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Bildung ebener Lipiddoppelschichten</td></tr><tr><td>Cholesterinhemisuccinat (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Stabilisierung von Membranproteinen</td></tr><tr><td>Coomassie-Brilliant-Blau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Proteinfärbung</td></tr><tr><td>Handelsübliches Chlorbleichmittel</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Chlorierung von Ag-Drahten</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Reduktion der Viskosität des Lysats</td></tr><tr><td>Doppeldestilliertes Wasser</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Herstellung von Puffern und Lösungen</td></tr><tr><td>Ethanol (rein, 99,9 %)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Reinigung von Ag/AgCl-Drahten</td></tr><tr><td>Äthidiumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>DNA-Färbung</td></tr><tr><td>Sehr feines Schleifpapier</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Entfernung der Ag/AgCl-Beschichtung von Drähten</td></tr><tr><td>eNPR 100 kHz-Verstärker</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektrophysiologische Aufzeichnungen</td></tr><tr><td>Gel-Out-Kit zur DNA-Extraktion aus Agarose</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>DNA-Reinigung</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA-Leiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA-Größenstandard</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Expression des ancTREK1-Proteins</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Pufferstoff</td></tr><tr><td>Hexadecan (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Vorbehandlung der Apertur</td></tr><tr><td>Hexan (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Lipidlösungsmittel</td></tr><tr><td>Hausgemachter 5&amp;times;-DNA-Ladefarbstoff</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>DNA-Probenherstellung</td></tr><tr><td>Hausgemachter 6&amp;times;-Laemmli-SDS-Puffer (reduzierend)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Probenherstellung für Proteine</td></tr><tr><td>Hausgemachte Entfärbelösung</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Entfärben von SDS-PAGE-Gelen</td></tr><tr><td>Hausgemachter HRV-3C-Protease</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Spaltung von Fusionsproteinen</td></tr><tr><td>Hausgemachter SDS-PAGE-Laufpuffer (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Elution von His-markierten Proteinen</td></tr><tr><td>Säulen für In-Batch-Reinigung</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Proteinreinigungsverfahren</td></tr><tr><td>Schüttelinkubator Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Zellkulturwachstum</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Elektrolyt und Pufferherstellung</td></tr><tr><td>LB-Brühe (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Leupeptin-Proteaseinhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Verhinderung des Proteinabbaus</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Bestandteil des Puffers</td></tr><tr><td>Nanodrop-Spektrophotometer</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Quantifizierung von DNA und Protein</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-Maltosid (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Löslichmachung von Membranproteinen</td></tr><tr><td>Ni-Sepharose-High-Performance-Harz</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>IMAC-Reinigung</td></tr><tr><td>Netbook (Computer)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Gerätesteuerung und Datenerfassung</td></tr><tr><td>Optima LE-80K-Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Isolierung von Membranfraktionen</td></tr><tr><td>Pentan (&amp;ge;99 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Lipidlösungsmittel</td></tr><tr><td>Pepstatin A-Proteaseinhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Verhinderung des Proteinabbaus</td></tr><tr><td>Phusion GC-Puffer (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>PCR-Puffer</td></tr><tr><td>Phusion-High-Fidelity-DNA-Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>PMSF-Proteaseinhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Protektionsmittel für Proteine während der Lyse</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>ProteinEle vorgefertigtes Tris-Glycin-Gel (4&amp;ndash;20 %)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Proteintrennung</td></tr><tr><td>SDS-PAGE-Gelelektrophorese-System</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Verstärker der Proteinsynthese</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>DNA-Ligation</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase-Puffer (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Ligationspuffer</td></tr><tr><td>Thermocycler (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Pufferherstellung</td></tr><tr><td>Tryptone-SOYA-Agar mit Lecithin und Polysorbat 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Bakterielle Ausplattierung</td></tr><tr><td>Zwei Ag-Drahten</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektroden für die Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Ultra-Spin-Konzentrator (50 kDa-Cutoff)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>pEG BacMam-Expressionsvektor</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Proteinsynthese</td></tr><tr><td>USB-Kabel</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Verbindung zwischen Verstärker und Computer</td></tr></tbody></table>

ein-kanal-elektrophysiologie unter verwendung eines miniaturisierten montal-mueller-planar-lipid-doppelschicht-systems zur aufzeichnung eines synthetischen k2p-kanals

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

Die funktionelle Rekonstitution von Ionenkanälen in planare Lipiddoppelschichten bietet eine Strategie zur Untersuchung der Kanalaktivität auf Einzelmolekülebene. Herkömmliche Montal-Mueller-Doppelschichtsysteme erfordern jedoch in der Regel umfangreiche experimentelle Aufbauten, manuelle Kammermontage und vergleichsweise große Aufzeichnungsvolumina, was den Reagenzienverbrauch erhöht und zusätzliche Quellen elektrischen Rauschens durch verlängerte Verkabelung und externe Verstärkerstufen einführen kann. Hier stellen wir eine miniaturisierte, gebrauchsfertige Doppelschichtplattform (BLMchipMM) vor, die mit einem kompakten Verstärker integriert ist und stabile Einzelkanalaufzeichnungen bei reduziertem Reagenzienverbrauch und vereinfachter Bedienung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung dieses Systems für die Durchführung von Einzelkanal-Elektrophysiologie-Messungen. Mithilfe dieses Systems rekonstituierten wir einen synthetischen K2P-Kanal (ancTREK1) und verwendeten ihn als Modellprotein, um Rekonstitution und Einzelkanalaufzeichnung zu validieren. Einzelkanalaufzeichnungen zeigen eine Strom-Spannungs-Beziehung in Mg2+-freien symmetrischen K+-Lösungen mit Leitfähigkeitswerten, die mit denen berichteten für TREK1-Kanäle übereinstimmen. Die erfolgreiche Rekonstitution dieses K2P-ähnlichen Kanals demonstriert die Eignung dieses Systems für die Einzelkanalanalyse in künstlichen Membranen.

Strom-Spannungs-(I–V-)Kennlinien von PLB-Membranen
Die intrinsisch hydrophobe Natur von Doppelschichtmembranen macht sie für geladene Spezies undurchlässig. Die Anwendung eines externen elektrischen Feldes kann jedoch die Bildung von transienten Poren im Nanometerbereich induzieren, wodurch die Membranpermeabilität und -leitfähigkeit beeinflusst wird33. Um die Qualität künstlicher Doppelschichten aus 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin-Lipiden zu beurteilen, wurden die Membrankapazität, der Widerstand und die Strom-Spannungs-Charakteristik (I–V) in Abwesenheit eingebetteter Proteine untersucht. Eine Reihe von Spannungsschritten im Bereich von ±20 bis ±200 mV (in Schritten von ±20 mV) wurde angelegt, und die resultierenden transmembranen Ströme wurden aufgezeichnet. Die Daten wurden mit 5 kHz abgetastet und mit einem Tiefpassfilter bei 2,5 kHz gefiltert.
Die Membrankapazität (Cm) und der Membranwiderstand (Rm) stellen zentrale Parameter zur Beurteilung der Doppelschichtqualität dar. Die PLB kann durch eine äquivalente Widerstand-Kondensator-Schaltung (RC-Schaltung) beschrieben werden, bei der die Membran wie ein Kondensator parallel zu einem Widerstand wirkt34. Die kapazitive Komponente spiegelt die Fähigkeit der Membran wider, Ladung zu speichern, während die resistive Komponente die Ionenpermeabilität widerspiegelt. Die Anwendung einer dreieckförmigen Spannungsform erzeugt eine quadratische kapazitive Stromantwort, die gemäß folgender Gleichung proportional zur Membrankapazität ist:
<img alt="Formel für den kapazitiven Strom I_c=C_m(dv/dt), zur Veranschaulichung der elektrischen Schaltungsanalyse." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equation 1">    (1)
Hier ist Cm die Membrankapazität, V die angelegte Spannung und t die Zeit. Nach der Membranbildung können die Kapazitätswerte im Laufe der Zeit ansteigen, da die Doppelschicht allmählich dünner wird35. Unter der Annahme, dass die Membran einem Plattenkondensator entspricht, ergibt sich die Beziehung zwischen Kapazität, Membranfläche und -dicke gemäß:
<img alt="Kapazitätsformel mit Lipiden, Gleichung, pädagogisches Diagramm, Dielektrizitätskonstante." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Gleichung 2">    (2)
Hier ist εlipids die Dielektrizitätskonstante des Lipidkerns (~2), ε0 die Permittivität des freien Raums, A die Membranfläche und d die Membrandicke36,37.
Der Membranwiderstand wurde mithilfe des Ohmschen Gesetzes33 bestimmt:
<img alt="Gleichung der elektromotorischen Kraft Ir=V/Rm, Bildungsdia­gramm für elektrischen Widerstand." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Gleichung 3">    (3)
Hier ist V die angelegte Spannung und Rm der Membranwiderstand. In Abwesenheit von Ionenkanälen bleibt der Membranstrom nahe 0 pA, was Widerstandswerten im Gigaohm-Bereich (GΩ) entspricht33.
Die Strom-Spannungs-Beziehung zeigte zwischen 0 und ±200 mV ein lineares (ohmsches) Verhalten für BLMchipMM-Geräte mit 75 und 100 µm Öffnung. Die lineare Anpassung der Daten ergab Membranwiderstandswerte von 847 ± 16 GΩ (n = 6) für die 75 µm-Öffnung (Abbildung 8A, Kreise) und 980 ± 32 GΩ (n = 7) für die 100 µm-Öffnung (Abbildung 8A, Quadrate). Die über 3-s-Abschnitte der Stromspur gemessenen RMS-Rauschwerte betrugen 3,1 ± 2 pA (n = 7) für die 100 µm-Öffnung und 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) für die 75 µm-Öffnung. Die Membranstabilität wurde durch Widerstandsmessungen in Abständen von etwa 2 min über eine Gesamtdauer von 1 h bewertet (Abbildung 8B). Gut gebildete Membranen blieben über 1 h stabil, was für die meisten elektrophysiologischen Experimente ausreichend ist. Die Membranen vertrugen typischerweise angelegte Potentiale bis ±200 mV, ohne Anzeichen von Instabilität zu zeigen, während der Durchbruch zwischen ±220 und ±300 mV erfolgte, abhängig von der jeweiligen Doppelschicht. Membranen galten als geeignet für die Proteineinlagerung, wenn die Kapazitätswerte zwischen 40 und 60 pF für 75 µm-Öffnungen und zwischen 60 und 90 pF für 100 µm-Öffnungen lagen und die Stromwerte bei 100 mV ≤0,5 pA betrugen.
<img alt="Spannung-Strom- und Widerstands-Zeit-Diagramme, Studie zur Doppelschichtmembran-Chip, Ergebnisse der Datenanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Abbildung 8"> 
Abbildung 8: Elektrische Charakterisierung von PLBs. (A) Strom-Spannungs-(I–U-) Beziehungen von Doppelschichten, die auf Aperturen mit 75 µm und 100 µm gebildet wurden, wobei ein lineares (ohmsches) Verhalten zwischen ±200 mV gezeigt wird. Die lineare Regression ergibt Membranwiderstandswerte von 847 ± 16 GΩ (n = 6) bzw. 980 ± 32 GΩ (n = 7). (B) Membranstabilität, bewertet durch die Überwachung des Widerstands über einen Zeitraum von 1 h in 2-minütigen Intervallen. Die Membranen bleiben bis zu ±200 mV stabil und reißen bei Spannungen zwischen ±220 und ±300 mV. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzusehen.</a>
Erste Charakterisierung des Einzelkanalverhaltens von ancTREK1
Synthetisches ancTREK1 wurde gereinigt und in PLBs rekonstituiert, und die Einzelkanalaktivität wurde mittels Spannungsschrittprotokollen im Bereich von −120 bis 120 mV in 20-mV-Schritten überwacht. Einzelkanalaufnahmen (Abbildung 9A und Abbildung 9B) zeigten das charakteristische Flackerverhalten von K2P Kanäle38Bei 80 mV betrug die mittlere Stromamplitude 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), während sie bei −80 mV auf −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) anstieg (Abbildung 9C). Die resultierende Strom-Spannungs-Beziehung zeigte messbare Einzelkanalströme sowohl bei positiven als auch bei negativen Potentialen unter Mg2+-freie symmetrische 200 mM Kaliumbedingungen (Abbildung 9DDa die Stromamplituden aus All-Point-Histogrammen von Aufnahmen ermittelt wurden, die bei 5 kHz aufgezeichnet und bei 2,5 kHz tiefpassgefiltert wurden, wird diese I–V-Beziehung als beschreibender Prinzipbeweis und nicht als umfassende biophysikalische Charakterisierung dargestellt.
<img alt="Analyse der Ionenkanalaktivität; Graph mit Stromspuren und Amplituden-Histogrammen bei +80 mV, -80 mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Abbildung 9"> 
Abbildung 9: Einzelkanalaktivität des synthetischen ancTREK1. (A und B) Repräsentative Einzelkanal-Stromspuren, aufgezeichnet bei 80 mV bzw. −80 mV. Gestrichelte Linien zeigen den geschlossenen Kanalzustand an. (C) Amplituden-Histogramme aller Messpunkte für positive (links) und negative (rechts) Potentiale. (D) Strom-Spannungs-Beziehung (I–V) von ancTREK1 unter symmetrischen Bedingungen mit 200 mM Kalium (K+) ohne zweifach geladene Kationen. Die Kurve wurde mit einem Polynom vierten Grades angepasst, und die Leitfähigkeitswerte wurden aus der Steigung bei ±80 mV abgeleitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Obwohl ancTREK1 im Vergleich zu den TREK1-Kanälen von Säugetieren keine verlängerten N- und C-terminale Bereiche aufweist, blieb es nach der Rekonstitution funktional aktiv. Im Gegensatz zu den TREK1-Kanälen von Säugetieren, die Modi mit hoher und niedriger Leitfähigkeit zeigen (132 ± 5 pS bzw. 41 ± 5 pS bei positiven Potentialen)39, zeigte ancTREK1 ausschließlich den Modus mit großer Leitfähigkeit. Die Einzelkanal-Leitfähigkeit bei positiven Potentialen betrug 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5) und liegt damit im Einklang mit berichteten Werten für TREK-Kanäle (85–130 pS unter symmetrischen Kaliumbedingungen)38,39,40,41. Bei negativen Potentialen stieg die Leitfähigkeit auf 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), was mit dem zuvor beschriebenen Verhalten von TREK1 übereinstimmt39. Bemerkenswert ist, dass ancTREK1 eine höhere normalisierte Öffnungswahrscheinlichkeit (NPo) aufwies im Vergleich zu TREK1-Messungen, die an ausgezogenen Patch-Konfigurationen durchgeführt wurden42. Die NPo-Spannungs-Beziehung zeigte eine erhöhte Kanalaktivität bei positiven Potentialen, wobei ein Wert von 0,78 ± 0,02 (n = 5) bei 80 mV erreicht wurde. Im Gegensatz dazu nahm die NPo bei negativen Potentialen ab, mit Werten von 0,53 ± 0,04 bei −80 mV und 0,28 ± 0,03 bei −120 mV (Abbildung 10).
<img alt="Ergebnisse der Ionenkanal-Elektrophysiologie, NPo gegenüber Spannung (mV) Diagramm, Balkendiagramm-Vergleich, Datenanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Abbildung 10"> 
Abbildung 10: Analyse der Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalaktivität von ancTREK1. Normalisierte Öffnungswahrscheinlichkeit (NPo) in Abhängigkeit vom Membranpotential (links) und Vergleich der NPo bei 80 mV und −80 mV (rechts), wobei eine erhöhte Kanalöffnung bei positiven Potentialen gezeigt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Abbildung 1 (Zusatzmaterial). Aminosäuresequenz des synthetischen, evolutionär ursprünglichen Kaliumkanals mit zwei Poren (K2P) (ancTREK1). Die vollständige Aminosäuresequenz von ancTREK1, die für elektrophysiologische Ableitungen verwendet wurde. Die Sequenz wurde durch Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenz aus einem kurierten Datensatz von TREK/TRAAK-Familienmitgliedern gewonnen, einschließlich orthologer Sequenzen aus den Datenbanken UniProt und NCBI, gefiltert nach konservierten Pormotiven, ausgerichtet und mittels Maximum-Likelihood-Phylogenetik analysiert.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines miniaturisierten Montal–Mueller-Planar-Lipid-Doppelschicht-Systems mit integrierter Verstärkung zur Durchführung stabiler Einzelkanalaufzeichnungen. Die Methode wird durch die Rekonstitution eines gereinigten synthetischen K2P-Kanals demonstriert, um die Systemleistung zu validieren.

Ein-Kanal-Elektrophysiologie unter Verwendung eines miniaturisierten Montal-Mueller-Planar-Lipid-Doppelschicht-Systems zur Aufzeichnung eines synthetischen K2P-Kanals

Die funktionelle Rekonstitution von Ionenkanälen in planare Lipidbilayer stellt eine Strategie dar, um die Kanalaktivität auf Einzelmolekülebene zu untersuchen. ...

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, die Funktion von Ionenkanälen und Transportproteinen mithilfe integrierter struktureller Biologie und elektrophysiologischer Techniken zu verstehen. Konventionelle Bilayer-Aufbauten erfordern komplexe Instrumentierung und manuelle Montage, während dies eine miniaturisierte, gebrauchsfertige Plattform ist, die einen kompakten Verstärker integriert.Zunächst bereiten Sie den Elektrophysiologie-Aufbau vor, indem Sie eine Instrumentenkalibrierung durchführen und die Silber- oder Silberchlorid-Elektroden vorbereiten. Stecken Sie die unchlorierten Enden der beiden Silberdrähte in die Buchsen der Leiterplatte (PCB). Platzieren Sie die chlorinierten Enden der Drähte in die in die Polymethylmethacrylat- (PMMA-)Komponente gebohrten fluidischen Kanäle. Drehen Sie vorsichtig den Black-Lipid-Membran-Chip (BLMchipMM) und montieren Sie ihn auf der Leiterplatte, indem Sie den unteren Zapfen der PMMA-Aufzeichnungskammer in den dafür vorgesehenen Schlitz einsetzen. Stellen Sie sicher, dass der Draht bis zum Ende der fluidischen Kanäle reicht. Bereiten Sie 100 Mikroliter einer 1 %igen (Volumen pro Volumen) Hexadecan-Lösung in 100 % n-Hexan zur Vorbehandlung d

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