Immunfärbungs- und Farbstoffpenetrationsexperimente zur Definition von Kern-Plezier-Septaten-Übergangsproteinen in Drosophila-embryonalen Epitheln
27. Februar 2026
Diese Protokolle beschreiben, wie die Organisation und Okklusionsfunktion plissierter Septatenübergänge in Kontroll- und mutanten-embryonalem Epithel von Drosophila charakterisiert werden kann.
Unsere Forschung untersucht die entwicklungsbedingten, nicht-okkludierenden Funktionen von Septaten-Junction-Proteinen und konzentriert sich auf die Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten, die an der Struktur und biologischen Rollen beteiligt sind. Dieses Protokoll soll die Organisation und Okklusionsfunktion plissierter Septatverbindungen im ektodermalen Epithel von Drosophila-Embryonen charakterisieren. Zu Beginn kreuzen Sie gesunde männliche und weibliche Drosophila-Fliegen mit den passenden Genotypen und setzen Sie sie in Embryonal-Sammelkäfige mit frischen Apfelsaftplatten, die mit Hefepaste bestrichen sind.
Lassen Sie die erwachsenen Tiere befruchtete Eier auf die Apfelsaftplatten legen. Nehmen Sie die Platte aus dem Käfig und lassen Sie die Embryonen nach der Eiablage 13 bis 16 Stunden bei 25 Grad Celsius altern, bis sie Stadium 16 erreichen. Anschließend werden die Embryonen des Stadiums 16 in einer geeigneten fixativen Lösung fixiert und die Immunfärbung mit den gewünschten Antikörpern durchgeführt.
Für beste Ergebnisse bilden Sie die Embryonen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv. Nachdem Sie sich auf den interessierten Embryo fokussiert haben, stellen Sie die Laserintensität und -verstärkung so ein, dass ein starkes fluoreszierendes Signal ohne Übersättigung der Pixel erreicht wird. Identifizieren Sie Embryonen im Stadium 16, die kein Balancer-codiertes grünes fluoreszierendes Protein ausdrücken, mithilfe der Mitteldarmmorphologie.
Fokussieren Sie den Scan auf die Speicheldrüse oder den Hinterdarm und positionieren Sie den Z-Scan so, dass der größtmögliche Durchmesser des Lumens berücksichtigt wird, um die gesamte laterale Membran der Epithelzelle sichtbar zu machen. Setzen Sie einen geeigneten Linienmittelwert ein und bilden Sie ein polarisiertes Gewebe in mindestens 20 Kontroll- und 20 Cora-4-Mutanten-Embryonen im Stadium 16 ab. Erfassen Sie Daten nur von Embryonen, bei denen der Adhärenz-Übergangsmarker eng im apikal-lateralen Bereich der Membran lokalisiert ist.
Bei Wildtyp-Embryonen im Stadium 16 wird die Anreicherung von plizierten septaten Junction-Proteinen entlang des apikalen Bereichs der lateralen Membran nahe dem Adherens-Übergang bewertet. Erfassen Sie die anhaltende Verteilung des plissierten septaten Übergangsmarkers entlang der lateralen Membran beim Mutanten. Stellen Sie eine frische Farblösung her, indem Sie rhodamin-markierte 10 Kilodalton-Dextran auf 1 Milligramm pro Milliliter in 0,5 molaren Natriumphosphat bei pH 7,5 mit 5 millimolaren Kaliumchlorid auflösen.
Mit einem Nadelzieher zieht man ein Kapillarrohr mit 1 Millimeter Außendurchmesser und 0,5 Millimeter Innendurchmesser mit Faser in eine Glasnadel. Anschließend wird die Glasnadel in den Nadelhalter auf einen Mikromanipulator gelegt und der Mikromanipulator neben einem umgekehrten Mikroskop angeordnet. Richten Sie die Nadel so nah wie möglich parallel zum Objektträger aus und senken Sie sie auf dieselbe Z-Ebene wie die Seite des Objektträgers.
Brechen Sie die Spitze der Nadel, indem Sie sie gegen die Seite des Objektträgers schlagen. Heben Sie die Nadel über das Niveau des Schlittens hinaus und nehmen Sie sie zum Laden ab. Als Nächstes füllen Sie das Kapillarrohr mit Farbstoff mit der kleinsten verfügbaren Pipettenspitze.
Füllen Sie die gefüllte Nadel in den Nadelhalter. Testen Sie den Durchfluss des 10-Kilodalton-Dextrans, indem Sie eine kleine Menge in einen Tropfen Halokarbonöl auf der Oberfläche eines Objektträgers injizieren. Mit einem 22 x 22 Millimeter dicken Deckel Nummer 2 erzeugen Sie eine eingekerbte Linie auf einer Apfelsaftplatte.
Stellen Sie jeweils etwa 25 Embryonen von Kontrolle und Cora 4 Mutant in Stadium 16 oder 17 auf der Apfelsaftplatte auf. Stellen Sie sicher, dass ihre hinteren Enden entlang der Linie ausgerichtet sind und die Bauchflächen nach oben zeigen. Dann klebt ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen 22 x 22 Millimeter großen Deckel Nummer 2.
Berühren Sie das Klebeband mit der Embryolinie und reiben Sie leicht den Deckel, um die Embryonen von der Platte auf das doppelseitige Klebeband zu übertragen. Gib als Nächstes einen Tropfen Halokarbonöl in einen Objektträger und befestigst den Deckelrutscher am Objektträger, indem kapillare Wirkung eine Bindung erzeugt. Richte den Deckelverschluss näher an der Seite des Schlittens aus, die einem gefrosteten Teil gegenüberliegt.
Trocknen Sie die Embryonen drei bis fünf Minuten in einem Behälter mit Trockenmittel und bedecken Sie sie vollständig mit Halokarbonöl. Montiere den Verschluss mit den Embryonen auf das umgekehrte Mikroskop, wobei die Embryonen nach oben und vom Ziel abgewandt sind. Richten Sie den Mikromanipulator so aus, dass die Nadel dem hinteren Ende der Embryonen in einem möglichst parallel zu den Embryonen liegenden Winkel zeigt, und stellen Sie die Z-Achse des Mikromanipulators so an, dass die Nadelspitze mit der Mitte des Embryos entlang der dorsal-ventralen Achse ausgerichtet ist.
Als Nächstes injizieren Sie die Embryonen, indem Sie die Stufe schnell in die Nadel bewegen, sodass die Nadelspitze in den Hämocoel eintritt. Injizieren Sie etwa 0,2 bis 0,5 Nanoliter Farbstoff mit einer 10-25- oder 50-Milliliter-Spritze. Ziehen Sie die Nadel schnell heraus und bewegen Sie die Stufe zum nächsten Embryo zur Farbstoffinjektion.
Dann gibt man zusätzliches Halokarbonöl über die Embryonen. Bedecken Sie die Embryonen mit einem 22 x 22 Millimeter großen Deckelverschluss Nummer 2, um eine gleichmäßige Ölschicht zwischen den Deckungsschleppern zu schaffen und Zerkleinern zu verhindern. Führen Sie nach der Dextran-Farbstoffinjektion Bildgebung mit einem fluoreszierenden Verbindungsmikroskop oder einem Konfokalmikroskop durch.
Am konfokalen Mikroskop wird ein Z-Stack durch etwa ein Viertel der Embryotiefe entlang der dorsal-ventralen Achse aufgenommen, um das Lumen der Luftröhre zu beurteilen. Untersuchen Sie das Lumen der Luftröhre, einer Speicheldrüse oder des Hinterdarms auf die Ansammlung von gekennzeichnetem Dextran. Erfassen Sie den Genotyp und das Entwicklungsstadium jedes Embryos und ob sich markiertes Dextran in einem röhrenförmigen Organ ansammelt.
Beachten Sie Embryonen, in denen der perivitelline Raum stark mit Farbstoff gefärbt ist, da dies eine unbeabsichtigte Injektion in diesen Raum darstellen kann. Bei Wildtyp-Embryonen war die makroglobulinkomplementbezogene Membran, oder Mcr, im Stadium 13 gleichmäßig entlang der lateralen Membran lokalisiert, reicherte sich im apikalen Bereich der lateralen Membran in Stadium 14 und war stark im apikal-lateralen Bereich lokalisiert, direkt basal gegenüber dem Adherens-Übergang im Stadium 16. Die kortikale Antikörperfärbung definierte die reifen, plissierten Septatenverbindungen in Wildtyp-Embryonen im Stadium 16 ähnlich wie MCR.
Bei Cora-4-mutierten Embryonen erreichte das MCR bis Stadium 16 keine starke apikale Lokalisation und blieb entlang der lateralen Membran verteilt. Die E-Cadherin-Lokalisierung war ähnlich bei Wildtyp- und Cora-4-Mutanten-Embryonen im Stadium 16. In Wildtyp-Embryonen im Stadium 17, die mit rhodamin-markiertem 10 Kilodalton-Dextran injiziert wurden, umgab der Farbstoff die Luftröhre, drang jedoch nicht in das Lumen ein.
Bei Cora 4 mutierten Embryonen im Stadium 17 sammelte sich der Farbstoff innerhalb von 10 Minuten nach der Injektion im Lumen der Luftröhre an. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, mit Sicherheit festzustellen, ob ein Gen den Kern oder die zusätzliche Komponente der plissierten Septatenverbindungen im embryonalen Gewebe von Drosophila codiert. Die Embryo-Stadieneinteilung ist bei dieser Technik absolut entscheidend, da dies Embryonen im Stadium 16 erfordert.
Die septaten Verbindungen reifen im Laufe der Zeit, bis sie vollständig in Stadium 16 etabliert sind. Wir glauben, dass dieses Protokoll effektiv in offenen genetischen Screenings mit RNA-Interferenzlinien implementiert werden kann, um neue plissierte Septaten-Junction-Gene zu identifizieren.
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Overview
This article presents protocols designed to evaluate the organization and barrier function of pleated Septate Junctions (pSJs) in ectodermally-derived epithelial tissues of Drosophila embryos. pSJs serve as an occluding barrier in tissues such as the epidermis, salivary glands, trachea, and hindgut, functioning similarly to vertebrate tight junctions. The described methods enable researchers to assess both the structural organization and functional integrity of pSJs in both control and mutant Drosophila embryos.
Key Study Components
Area of Science
- Developmental biology
- Cell biology
- Drosophila genetics
Background
- pSJs are critical for forming an occluding barrier in Drosophila epithelial tissues.
- They are composed of at least 30 proteins required for their formation.
- Core pSJ proteins localize along the lateral membrane and become enriched at the apical lateral region by stage 16 of embryogenesis.
- By late stage 15, these tissues have a fully functional occluding junction.
Purpose of Study
- To evaluate the organization of pSJs in Drosophila embryos.
- To assess the barrier function of pSJs in various epithelial tissues.
- To provide protocols for testing whether unknown genes encode core pSJ components.
Methods Used
- Immunostaining to visualize pSJ protein localization.
- Dye permeability assays to test occluding barrier function.
- Comparative analysis of control and mutant embryos.
Main Results
- Protocols allow for the demonstration of pSJ occluding function.
- Enable identification of defects in pSJ organization or function in mutants.
- Support testing of candidate genes for roles in pSJ formation.
Conclusions
- The described protocols are effective for interrogating pSJ structure and function in Drosophila embryos.
- They facilitate the identification of core pSJ components and assessment of gene function.
- These methods advance understanding of epithelial barrier formation in invertebrates.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Defining the organization and barrier function of pleated Septate Junctions (pSJs) in Drosophila embryonic epithelia addresses a critical challenge in validating epithelial barrier models for early discovery. Quantitative immunostaining and dye penetration assays provide predictive confidence in the functional integrity of candidate junctional proteins, supporting mechanistic de-risking and target validation. These protocols enable robust assessment of gene function in epithelial barrier formation, informing risk-adjusted advancement in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of candidate gene function in epithelial barrier assembly.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the role of core junctional proteins.
- Provides functional evidence for target validation in barrier-forming tissues.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream permeability and localization assays.
- Facilitates assay standardization and reproducibility through quantitative immunostaining and dye penetration outputs.
- Enables reliable evaluation of genetic or chemical perturbations affecting junctional integrity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of epithelial barrier dysfunction when extending findings to vertebrate systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of barrier-modulating targets.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development in epithelial integrity studies.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position within the early discovery continuum, bridging target validation and assay development for epithelial barrier research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene function in junctional assembly and barrier formation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for permeability and protein localization.
- Analytics: Provides measurable readouts to compare control and mutant conditions.
- Translational Research: Offers a foundation for preclinical continuity in barrier function studies.
- Enterprise Reuse: Protocols are adaptable for evaluating additional candidate genes or perturbations in epithelial models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in barrier function.
- Operational Value: Standardizes and scales immunostaining and permeability assays for cross-study reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in epithelial barrier programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets implicated in epithelial integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics and epithelial tissue handling.
- Needs access to fluorescence microscopy and quantitative imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of immunostaining and dye penetration protocols.
- Adaptable to other model systems with appropriate protocol modifications.
- Limitations include model organism specificity and potential differences from vertebrate tight junctions.
