Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien

Wir untersuchen, wie eine Überexpression eines Proteins in einer nicht-immunogenen Zelllinie zur Übernahme von krebsstämmigen Eigenschaften führt. Dieses Protokoll verwendet ein minimales Medium, das mit B-27 und EGF ergänzt wird, was es kosteneffektiver macht. Zu Beginn beschichten Sie jede Welle einer Standard-Gewebekulturplatte mit sechs Bohrungen mit einem Milliliter 1,2%-Poly-2-Hydroxyethyl-Methacrylatlösung und setzen Sie die Platte in einen Ofen, der bei 40 Grad Celsius eingestellt ist, um unter sterilen Bedingungen zu trocknen.

Setzen Sie die getrocknete Platte 15 Minuten lang ultraviolettem Licht aus. Anschließend wird jeder Brunnen dreimal mit Dulbeccos PBS gewaschen, bevor die Platte verwendet wird, um den Mammosphären-Formationstest einzurichten. Nehmen Sie eine zuvor kultivierte 3D-dissoziierte MCF-10A-Zellkulturschüssel auf und entfernen Sie das verbrauchte Medium.

Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter Dulbeccos PBS. Anschließend fügen Sie 500 Mikroliter 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%-Kohlendioxid-Inkubator für 12 bis 15 Minuten, bis die Zellen trypsinisiert sind. Sobald die Zellen gelöst sind, fügen Sie zwei Milliliter Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren.

Lassen Sie die Zellsuspension bei 112 G 10 Minuten bei Zimmertemperatur drehen. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das entstehende Zellpellet in einem Milliliter Mammosphärenmedium. Führen Sie die Zellsuspension durch eine 25-Gauge-Nadel, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.

Als Nächstes zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen. Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension, um 2000 Zellen pro Bohrloch zu säen. Verdünnen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in zwei Millilitern Mammosphärenmedium pro Bohrloch und säen Sie die verdünnte Suspension in jede Mulde einer Sechs-Wellen-Platte, wobei drei Replikationsbrunnen für jede Bedingung vorbereitet werden.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%-Kohlendioxid-Inkubator für sieben Tage. Nach sieben Tagen zählen Sie manuell die Anzahl der Mammosphären größer als 50 Mikrometer in jedem Brunnen. Bilde die Mammosphären mit einer Digitalkamera, die an ein Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung angeschlossen ist, und berechnen Sie die Effizienz der Mammosphärenbildung anhand der angegebenen Formel.

Sammeln Sie die Mammosphären der ersten Generation in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie das Supernatant vorsichtig ab und lassen Sie das Mammosphärenpellet am Boden des Rohrs unversehrt. Wasche das Pellet mit Dulbeccos PBS.

Zentrifugiere die Zellsuspension, um ein Mammosphären-Pellet zu erhalten, und pipettiere dann das PBS des Dulbecco, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie nun 200 Mikroliter 0,05 % Trypsin-EDTA zum gewaschenen Pellet und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%-Kohlendioxid-Inkubator zwei bis drei Minuten. Anschließend werden die Mammosphären in Trypsinlösung dreimal durch eine 25-Gauge-Nadel geführt, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Anschließend werden 0,5 Milliliter Resuspensionsmedium hinzugefügt, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 112 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Millilitern Mammosphärenmedium.

Mit einem Hämozytometer zählen Sie die Anzahl der Zellen und berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension, um 2000 Zellen pro Bohrloch zu säen. Verdünnen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in zwei Millilitern Mammosphärenmedium pro Bohrloch und säen Sie in jede Mulde einer Sechs-Loch-Platte, wobei für jede Bedingung drei Replikationsbrunnen vorbereitet werden. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%-Kohlendioxid-Inkubator für sieben Tage.

Nach sieben Tagen zählen Sie die Anzahl der Mammosphären mit einem Durchmesser von mehr als 50 Mikrometern in jedem Bohrloch. Stellen Sie sich die Mammosphären unter 20-facher Vergrößerung vor und berechnen Sie die Selbsterneuerungskapazität anhand der gegebenen Formel. Sammeln Sie die Mammosphären der ersten Generation in ein 15-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Saugen Sie das Supernatant vorsichtig ab, damit das Mammosphärenpellet am Boden des Röhrchens unberührt bleibt. Waschen Sie das Pellet vorsichtig mit Dulbeccos PBS. Nach dem Entfernen des PBS wird das gewaschene Pellet in einen eiskalten RIPA-Puffer gesammelt, um das Proteinlysat zu erhalten, und das Immunoblotting nach dem Standardprotokoll durchgeführt.

Quantifizieren Sie schließlich die Proteinniveaus mittels einer densitometrischen Analyse in Bild J. Wählen Sie die Interessenregion auf dem West-Blot-Bild aus und erstellen Sie für jede Spur und den Pluripotenzmarker ein Dichteprofil. Normalisiere die relativen Dichten des interessierten Proteins mit denen von GAPDH für jede Spur und berechne dann die Faltungsänderung für jedes Protein. API5-überexprimierende MCF-10A-Zellen zeigte eine 1,58-fache Steigerung der durchschnittlichen Mammosphärenbildungseffizienz im Vergleich zu Kontrollzellen unter nicht adhärenten, serummangelten Bedingungen.

Diese Zellen bildeten Mammosphären der zweiten Generation mit einer Selbsterneuerungskapazität, die fast 2,5-mal höher ist als die der Kontrollzellen. Immunoblotting zeigte eine erhöhte Expression von Okt 3/4, Nanog, Sox 2 und BMI1 in API5 gegenüber der exprimierten primären Mammosphären im Vergleich zu Kontrollgruppen. Densitometrische Analysen zeigten einen 1,83-fachen Anstieg am 4. Oktober, einen 1,65-fachen Anstieg von Nanog, einen 1,68-fachen Anstieg von Sox 2 und einen 1,62-fachen Anstieg der BMI1-Werte bei API5 gegenüber exprimierenden Mammosphären im Vergleich zu Kontrollgruppen.

Eine Herausforderung im Protokoll besteht darin, die Zellanzahl zu standardisieren, um eine ausreichende Mammosphärenbildung ohne Zellaggregation sicherzustellen. Mammosphären, die durch dieses Protokoll erzeugt werden, können auch verwendet werden, um die Proteinlokalisierung in einem dreidimensionalen Kontext mittels Immunfluoreszenz zu visualisieren.