Name: Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie den Mammosphärentest zur Untersuchung von Api5-induzierter Stammzellbildung in MCF-10A-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Selbsterneuerung und Stammzellmarkern in vitro.

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1. Beschichtung von Gewebekulturplatten mit Poly(2 -Hydroxyethylmethacrylat), pHEMA
<ol>
	<li>Lösen Sie 1,2 g pHEMA (Molekulargewicht ̴ 300.000) in 100 ml 95 % Ethanol durch ständiges Rühren bei 65 °C auf, um eine 1,2 % pHEMA-Lösung herzustellen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Beschichten Sie Standard-Gewebekulturplatten mit pHEMA, indem Sie pro Bohrloch einer 6-Well-Platte 1 ml auftragen. Das Volumen der pHEMA-Lösung kann je nach Größe des Gewebekulturgefäßes angepasst werden.</li>
	<li>Lassen Sie die Teller unter sterilen Bedingungen im Ofen bei 40 °C trocknen.</li>
	<li>Die Platten werden 15 Minuten lang UV-Licht ausgesetzt, gefolgt von drei Washes mit Dulbeccos phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (DPBS), bevor Sie sie zur Vorbereitung des Mammosphären-Formationstests verwenden.</li>
</ol>
2. Aussäen von Mammosphären der Primärgeneration
<ol>
	<li>Kultur 3D-dissoziierte MCF10A-Zellen (Kontroll- und Api5-Überexpression), die durch Dissoziation von 3D-Kulturen am Tag 16 im Wachstumsmedium14 gewonnen wurden. HINWEIS: Zusammensetzung des Wachstumsmediums: DMEM mit hohem Glukosespiegel ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit 5 % Pferdeserum, 10 μg/mL Insulin, 0,5 μg/mL Hydrocortison, 20 ng/mL rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng/mL Choleratoxin und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Entferne das verbrauchte Medium, wasche die Zellen mit 1 ml DPBS, gib dann 500 μL 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubiere bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator für 12–15 Minuten, bis alle Zellen trypsinisiert sind. </li>
	<li>Nachdem alle Zellen gelöst sind, fügen Sie 2 ml Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und drehen Sie die Zellsuspension bei 112 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. HINWEIS: Zusammensetzung des Resuspensionsmediums: Hoher Glukose-DMEM ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit 20 % Pferdeserum und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in 1 ml Mammosphärenmedium wieder suspendieren. Führen Sie die Zellsuspension durch eine 25-G-Nadel, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. HINWEIS: Zusammensetzung des Mammosphärenmediums: DMEM/F12 ergänzt mit 20 ng/mL epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 1 × B27-Präparat ohne Vitamin A und 200 Einheiten/mL Penicillin-Streptomycin (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Mit einem Hämozytometer zählen Sie die Anzahl der Zellen und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um 0,2 × 104 Zellen pro Brunnen zu säen. HINWEIS: Halten Sie eine niedrige Aussaatdichte aufrecht, um die Effizienz der Mammosphärenbildung genau zu bestimmen und so die Auswirkungen der Zellaggregation zu minimieren. Beim Sammeln von Proteinlysaten zur Immunblottung kann die Zelldichte auf bis zu 2,5 × 105 Zellen pro Welle erhöht werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in 2 ml Mammosphärenmedium und Samen in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Samenzellen in dreifacher Ausführung für jede Bedingung.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Inkubator für 7 Tage. </li>
	<li>Nach sieben Tagen in der Kultur zählen Sie manuell die Anzahl der Mammosphären mit einem Durchmesser von mehr als 50 μm in jedem Bohrloch, entweder mit einem Mikroskop mit einem Graticule oder mit einem Quadrantengitter unter einem Lichtmikroskop.</li>
	<li>Fotografieren Sie die Mammosphären mit einer Digitalkamera, die an ein Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung angebracht ist.</li>
	<li>Berechnen Sie die Mammosphärenbildungseffizienz (MFE) mit folgender Formel5 
	 <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Säen von Mammosphären der sekundären Generation
<ol>
	<li>Sammeln Sie die Mammosphären, die in der ersten Generation entstanden sind, in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspiratiere das Supernatant und lass das Mammosphärenpellet zurück.</li>
	<li>Wasche das Pellet mit DPBS.</li>
	<li>Fügen Sie dem Mammosphere-Pellet 200 μL 0,05 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 % Inkubator für 2–3 Minuten. Führen Sie die Mammosphären in der Trypsinlösung dreimal durch eine 25-G-Nadel, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>Gib 0,5 ml Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und drehe die Zellsuspension bei 112 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Supernatant und lassen Sie das Zellpellet in 0,5 mL Mammosphärenmedium wieder suspendieren.</li>
	<li>Mit einem Hämozytometer zählen Sie die Anzahl der Zellen und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das benötigt wird, um 0,2 × 10 bis4 Zellen pro Bohrloch zu säen. HINWEIS: Halten Sie eine niedrige Zelldichte aufrecht, um die Selbsterneuerungskapazität zu bewerten und so die Wirkung der Zellaggregation zu minimieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie das erforderliche Zellsuspensionsvolumen in 2 ml Mammosphärenmedium und Samen in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte. Samenzellen in dreifacher Ausführung für jede Bedingung.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2-Inkubator für 7 Tage.</li>
	<li>Nach 7 Tagen in der Kultur zählen Sie die Anzahl der Mammosphären mit einem Durchmesser von mehr als 50 μm in jeder Platte entweder mit einem Mikroskop mit einem Graticule oder einem Quadrantengitter.</li>
	<li>Fotografieren Sie die Mammosphären mit einer Digitalkamera, die an ein Lichtmikroskop mit 20-facher Vergrößerung angebracht ist.</li>
	<li>Berechnen Sie die Selbsterneuerungskapazität mit folgender Formel5 
	<img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western-Blotting zur Erkennung der Veränderungen der Pluripotenzmarker bei Api5-Überexpression
<ol>
	<li>Sammeln Sie die in der ersten Generation entstandenen Mammosphären in einem 15-mL-Rohr und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspiratiere das Supernatant und lass das Mammosphärenpellet zurück.</li>
	<li>Wasche das Pellet mit DPBS.</li>
	<li>Sammeln Sie das Pellet in einem eiskalten RIPA-Puffer, um das Proteinlysat zu erhalten, und führen Sie Immunoblotting gemäß Standardprotokoll24 durch. HINWEIS: Zusammensetzung des RIPA-Puffers: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA), 1 mM Phenylmethysulphonylfluorid (PMSF), 10 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat.</li>
	<li>Sonde für Stammmarker – Okt3/4, Nanog, Sox2 und Bmi1 sowie Belastungskontroll-GAPDH (siehe Materialtabelle für Antikörperverdünnungen).</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Proteinspiegel mittels densitometrischer Analyse auf ImageJ. Wählen Sie die interessante Region auf Western-Blot-Bildern aus und erstellen Sie für jede Spur ein Dichteprofil.</li>
	<li>Normalisiere die relativen Dichten des interessierenden Proteins zu denen von GAPDH für jede Spur. Berechnen Sie die Faltungsänderung für jedes Protein.</li>
	<li>Plotte die Faltung der Proteinwerte mit einer beliebigen Plottsoftware.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidifizierter Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Kaninchen pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 Verdünnung, über Nacht bei 4 &deg;C inkubieren</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Antikörper</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 Verdünnung, 1 h Inkubation bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Kaninchen mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 Verdünnung, über Nacht bei 4 &deg;C inkubieren</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antikörper (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 Verdünnung, über Nacht bei 4 &deg;C inkubieren</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikörper (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 Verdünnung, über Nacht bei 4 &deg;C inkubieren</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung (50x), ohne Vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL Stammlösung in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermales Wachstumsfaktor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL Stammlösung in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolut 99,9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>Hochglukoses DMEM ohne Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Zum Einstellen des pH-Werts von Tris-HCl (pH 8,0)</td></tr><tr><td>Hydrocortison&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL Stammlösung in Ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminiszenz HRP-Substrat</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL Stammlösung in 1% eisige Essigsäure</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A Zellen</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting-Software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylat) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1,2% pHEMA in 95% Ethanol</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdeoxycholat</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Puffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

der mammosphärentest zeigt api5-induzierte stammbildung in nicht-tumorigenen brustepithelzelllinien

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Zur Bewertung der Effizienz der Mammosphärenbildung unter nicht-adhärenten Bedingungen wurden Kontroll- und Api5-überexprimierende 3D-dissoziierte MCF10A-Zellen gemäß dem Protokoll auf polyHEMA-beschichtete Platten ausgesaat. Api5-überexprimierende Zellen zeigten eine 1,58-fache Steigerung der durchschnittlichen Effizienz der Mammosphärenbildung im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 1B,C). Dieser Anstieg zeigt, dass eine höhere Expression von Api5 den Anteil der stammzel...

Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt die Isolierung von Krebsstammzellen aus Brustkrebszelllinien. Wir kultivieren diese Krebsstammzellen, um primäre Mammosphären zu erzeugen, um die Selbsterneuerung zu beurteilen und die Effizienz der Kugelbildung zu berechnen, was einen Vergleich über verschiedene Aussaatdichten hinweg ermöglicht.

Erzeugung primärer Mammosphären: Eine Technik zur Bestimmung der Zellpotenz

Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für&gt; 6 Monate.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

In-vitro-Kugel-Assays werden häufig verwendet, um Krebsstammzellen zu identifizieren. Hier vergleichen wir Einzel- mit Multizell-basierten Kugel-Assays. Die aufwendigeren einzelzellbasierten Assays oder die Methylcellulose-Supplementierung liefern genauere Ergebnisse, während mehrzellige Assays, die in flüssigem Medium durchgeführt werden, stark von der Zelldichte beeinflusst werden können.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden.  Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Ziel dieser Methodik ist es, Krebsstammzellen (CSC) in Krebszelllinien und primären menschlichen Tumorproben mit dem kugelbildenden Protokoll auf robuste Weise zu identifizieren, wobei funktionelle Assays und phänotypische Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und western Fleck.

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Hier beschreiben wir die Umsetzung und Interpretation der Ergebnisse eines in vitro Mammosphären-Selbsterneuerungquantitativen Assays.

Quantifizierung der Selbsterneuerung in Murine Mammosphärenkulturen

Dieses Protokoll bietet experimentelle In-vitro-Werkzeuge zur Bewertung der Transformation menschlicher Brustzellen. Detaillierte Schritte zur Nachverfolgung der Zellproliferationsrate, der verankerungsunabhängigen Wachstumskapazität und der Verteilung von Zelllinien in 3D-Kulturen mit Kellermembranmatrix werden beschrieben.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

Lernen Sie den Mammosphärentest zur Untersuchung von Api5-induzierter Stammzellbildung in MCF-10A-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Selbsterneuerung und Stammzellmarkern in vitro.

Der Mammosphärentest zeigt api5-induzierte Stammbildung in nicht-tumorigenen Brustepithelzelllinien

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