Testen der physiologische Barrieren für die virale Transmission in Blattläuse mit Mikroinjektion

Wenn sie effektive Überträger von Pflanzenviren sind, und wenn es um die Mikroinjektion von Viren geht, ist die Methode, die wir Ihnen heute zeigen, eine Technik, die es Forschern ermöglicht, Viren direkt in die Hämocyten der AFib zu injizieren, wodurch der Darm umgangen wird – eine der beiden Hauptbarrieren für die zirkulative Virusübertragung. Hallo, ich bin Cecilia Tamrin Dehi, Postdoktorandin in der Abteilung für Pflanzenpathologie an der Cornell University. Heute zeige ich Ihnen, wie man Viren in die Hämocyten der AFI injiziert, sodass diese anschließend auf verschiedene Pflanzenarten übertragen werden können.

Beispielsweise ist diese FE-Pflanze mit dem Kartoffelblattrollvirus (PLRV) infiziert. Sie können den Unterschied zwischen einer gesunden und einer infizierten Pflanze erkennen. Das auffälligste Symptom ist die Blattversteifung.

PLRV ist ein Luteovirus, das von APHIS in ihrem Hämolymphe, dem Insektenäquivalent zum Säugetierblut, transportiert wird. Wenn eine nicht infizierte AFI eine infizierte Pflanze anfressen, nimmt sie das Virus über den Pflanzensaft auf, wie Sie hier sehen können. Nach der Aufnahme muss das Virus vom Insektenmagen in den Hämolympf gelangen und anschließend die Speicheldrüse passieren, um anschließend wieder auf die ESE-Pflanze übertragen werden zu können.

Und wenn beim Fressen an einer ESE-Pflanze möglicherweise viele Viren aufgenommen werden, durchläuft jedoch nur ein größerer Anteil den Darm und die Speicheldrüse. Die beiden Hauptbarrieren für die Übertragung, um mehr Pflanzen zu infizieren, müssen getestet werden. Wenn ein AFI außerstande ist, ein Virus zu übertragen, füttern wir die AFIs zwei Tage lang mit infektiösem Gewebe und lassen sie anschließend fünf Tage lang an einer gesunden Pflanze fressen.

Die Pflanze wird anschließend fumigiert, und nach drei Wochen beginnen wir mit der Suche nach Symptomen. Wenn wir eine AFib finden, die ein Virus nicht übertragen kann, können wir mithilfe des Mikroinjektionsverfahrens, das ich Ihnen heute zeigen werde, beurteilen, welche der beiden Barrieren das Virus aufhält. Bei diesem Verfahren wird das Virus direkt in die Hämocyten injiziert, wodurch die Darmübertragungsbarriere umgangen wird.

Beginnen wir also, und ich werde Ihnen zeigen, wie man einige Apex mikroinjiziert. Dies ist das Glas, die Glasnadeln, die wir verwenden. Wir ziehen die Glasnadeln aus diesen Glasröhrchen mithilfe einer APU apu.

Das ist also der Mikroinjektor. Um das Virus mikroinjizieren zu können, werde ich die Nadel nun in den Nadelhalter einsetzen.

Ich setze nun die Nadel ein und bringe sie in Position. Jetzt werde ich das Virus in die Nadel bis zum oberen Ende dieses Schafts laden. Jetzt müssen wir die AFI für die Mikroinjektion positionieren.

Ich werde also eine AFI mit dem Schmerzdruck nehmen und sie in den AFI-Halter einsetzen. Idealweise werde ich versuchen, die Rückseite des Blattlauses gegen den Halter zu platzieren, damit ich Zugang zum Bauchteil der AFib habe. Okay, gut.

Jetzt können wir mit der Mikroinjektion fortfahren. Gut, jetzt positioniere ich die Nadel und führe sie näher an das AFib heran. Nun bringe ich die Nadel in Kontakt mit dem AFib und durchdringe das Exoskelett. Am besten gelingt dies, wenn man zwischen den Segmenten an der Basis der Beine einsticht.

Ich werde nun injizieren. Jetzt nehme ich das AFI mit der Bürste auf und gebe es auf das Abstrichpapier, wo es einen Moment lang ruhen wird. Außerdem müssen wir auch eine Kontroll-AFI mikroinjizieren.

Diese Kontroll-Mikroinjektion wird ausschließlich mit dem Puffer ohne Virus durchgeführt. Der verwendete Puffer ist ein 0,1-molares Phosphatpuffer mit pH 7. Daher werde ich das Afit in einer gesunden Pflanze platzieren, wo ich es fünf Tage lang wirken lasse. Anschließend werde ich die Pflanze inak­ti­vie­ren und nach der Mikroinjektion des einzelsträngigen NA über eine Woche hinweg täglich die Entwicklung von Symptomen beobachten. Dabei wird jeden Tag die Expressionsstärke des Zielgens im Afi gemessen.

Wir haben also gerade ein Afit mikroinjiziert, das das Virus nicht übertragen konnte. Wenn nach der Mikroinjektion das AFI in der Lage ist, das Virus zu übertragen, bedeutet dies, dass dieses AFI eine Darmbarriere besitzt, die das Virus blockiert hat. Wenn hingegen keine Symptome auftreten, wird dies bedeuten, dass dieses Afit eine starke Speicheldrüsenbarriere aufweist.

Wir haben soeben gezeigt, wie man Viren in Blattläuse mikroinjiziert. Dieselbe Methode wird verwendet, um doppelsträngige RNA in die Blattläuse einzuspritzen, um eine RNI-Augeninterferenz durchzuführen, eine interessante Technik, die dabei hilft, die Genfunktion bei Blattläusen zu untersuchen. Damit ist die Mikroinjektion abgeschlossen.

Ich hoffe, es gefällt Ihnen und wird für Ihre Experimente hilfreich sein. Vielen Dank.