Phänotypisches Profilieren von MPTP-induzierten, Parkinson-ähnlichen Verhaltensphänotypen bei Zebrafischlarven basierend auf Verhaltensexperimenten

Wir präsentieren ein multiparametrisches Verhaltensprotokoll, um motorische und nicht-motorische Parkinson-Phänotypen bei Larven-Zebrafischen umfassend zu profilieren. Dieses Protokoll gilt für Parkinson-Modellierungen, Arzneimittelscreening, Umweltneurotoxizität und Studien mit den Fischlarven. Zu Beginn tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, darunter Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrillen.

Verdünne eine 100-fache E3-Fondlösung im Verhältnis von eins zu 100 mit ultrareinem Wasser, um ein Medium mit einer einfachen Stärke herzustellen. Wähle nun geschlechtsreife männliche und weibliche erwachsene Zebrafische aus. Mit Zuchtbecken und abnehmbaren Trennwänden führen Sie kontrollierte Zucht durch.

Um 20:00 Uhr werden männliche und weibliche Zebrafische in getrennte Bereiche der Brutbecken gesetzt, im Verhältnis von zwei Männchen zu drei Weibchen, wobei Trennwände verwendet werden, um sie voneinander zu trennen. Am nächsten Morgen um 8:00 Uhr entfernen Sie die Trenner, um die Paarung zu ermöglichen. Sammeln Sie die Embryonen eine Stunde später ein und waschen Sie sie dreimal mit sauberem Wasser.

Lagern die Embryonen in 100-Millimeter-Petrischalen mit 20 Millilitern frischem E3-Medium. Anschließend werden die Embryonen bei 28 Grad Celsius unter einem 14-Stunden-Licht- und 10-Stunden-Dunkelzyklus ausgebrütet. Einen Tag nach der Befruchtung werden unbefruchtete, fehlgeformte und abnormale Embryonen vorsichtig mit einer Weidepipette entfernt.

Aspirieren Sie das Medium langsam vom Rand der Petrischale und fügen Sie frisches E3-Embryomedium entlang der Wand der Petrischale hinzu, um eine Störung der Wildtyp-Embryonen zu minimieren. Für die MPTP-behandelte Gruppe verwenden Sie eine 50-mikromolare MPTP-Lösung. Vier Tage nach der Befruchtung modifizieren Sie eine drei-Milliliter-Weidepipette, indem Sie 10 Millimeter von der Spitze abschneiden, um eine breite Bohrung zu erzeugen.

Um 18:00 Uhr verwenden Sie die modifizierte Pipette, um Zebrafischlarven aus jeder Gruppe auszuwählen und pro Brunnen eine Larven in eine 96-Well-Platte zu übertragen. Beobachten Sie jeden Brunnen unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass jede Zebrafischlarve gesund aussieht. Überprüfen Sie, dass die Flossen offen und regelmäßig schwingen, der Körper aufrecht steht und die Schwimmleiter aufgeblasen ist.

Reinigen Sie anschließend sorgfältig den Boden der Platte, um zu verhindern, dass Schmutz die Videoaufnahme beeinträchtigt. Dann übertrage die 96-Well-Platte zentral auf den Boden der Zebrabox-Kammer. Wähle den Quantisierungsmodus in der Video-Tracking-Software.

Für die Überwachung der Schlaf-Wach-Regelung stellen Sie die Lichteinstellung so ein, dass das Licht um 22:00 Uhr ausgeschaltet und um 8:00 Uhr eingeschaltet wird. Konfigurieren Sie die Softwareparameter so, dass die Erkennungsschwelle auf 40, Burst auf 25, Einfrieren auf vier, Gesamtüberwachungszeit auf 52 Stunden und dann auf 60 Sekunden dimensioniert wird. Beginnen Sie das Schlaf-Wach-Verfahren um 8:00 Uhr PM.To überwachen Sie die fotomotorischen Reaktionen, setzen Sie die Larven fünf Tage nach der Befruchtung in eine 96-Well-Platte mit jeweils einer Larve pro Brunnen. Dann stellen Sie das Lichtübergangsprogramm auf 0 bis 60 Sekunden Dunkelheit ein, gefolgt von 60 bis 120 Sekunden konstantem Licht.

Starten Sie das Protokoll und sammeln Sie alle sechs Sekunden während des 120-sekündigen Tests Bewegungsparameter. Stoppen Sie das Protokoll bei 120 Sekunden und exportieren Sie die Datendatei. Dann werden die Larven für fünf Minuten in völliger Dunkelheit gelegt, um sie für den anschließenden Dunkellicht-Assay zu gewöhnen.

Stellen Sie das Lichtübergangsprogramm so ein, dass es Stroboskoplicht bei 10 Hertz für 60 Sekunden liefert. Um Thigmotaxis zu beurteilen, wählen Sie zwei Sechs-Well-Platten aus. Füllen Sie jeden Brunnen mit vier Millilitern E3-Medium.

Fünf Tage nach der Befruchtung werden Zebrafischlarven aus der Wildtypgruppe und der MPTP-behandelten Gruppe gesammelt und in sechs separate Brunnenplatten gelegt. Vor der Thigotacaxis-Untersuchung werden die Brunnenplatten für 15 Minuten in die Zebrabox gelegt, um die Eingewöhnung zu ermöglichen. Dann verwenden Sie die Zeichenflächenfunktion, um in jedem Brunnen zwei konzentrische Kreise zu zeichnen, wobei der innere Kreisradius der Hälfte des Radius des Bohrlochs entspricht, und beginnen Sie mit der Bewertung.

Für eine Locomotor-Bewertung werden fünf Tage alte Zebrafischlarven aus der Wildtypgruppe und der MPTP-behandelten Gruppe auf zwei separate 12-Brunnenplatten übertragen. Nach einer 15-minütigen Akklimatisierung wählen Sie den Online-Tracking-Analysemodus und zeichnen Sie die Bewegungsaktivität fünf Minuten lang mit dem automatisierten Video-Tracking-System auf. Für den Startle-Response-Test werden fünf Tage alte Larven einzeln in zwei 12-Bohrloch-Platten übertragen, mit einer Larve pro Bohrloch und zwei Millilitern E3-Medium.

Stellen Sie die Teller für eine fünfminütige leichte Eingewöhnungsphase in die Zebrabox. Starten Sie die ZebraLab-Software und aktivieren Sie den Online-Tracking-Analysemodus. Öffnen Sie die Licht-Trigger-Schnittstelle, wählen Sie dann aus, verwenden Sie eine der drei untenstehenden Auslösermethoden und aktivieren Sie verbesserte Reize.

Dann stellst du die Startmethode auf den Zeitpunkt ein, an dem die Sitzung beginnt. Im Übergangsplan definieren Sie den Dunkelblitzrhythmus. Stellen Sie das Programm so ein, dass es nach 21 Sekunden ausgelöst wird, dann stellen Sie den Übergang von 1 bis fünf Millisekunden mit 100 % Lichtintensität ein.

Übergang von zwei zu 2, 890 Millisekunden mit 100 % Lichtintensität. Übergang von drei bis fünf Millisekunden bei 0 % Lichtintensität und vier bis 100 Millisekunden mit 0 % Lichtintensität. Kreuze das Kästchen für Wiederholungsliste von Übergängen an, um regelmäßiges Flashen sicherzustellen, und starte dann das Protokoll.

Für den Light-Dark-Challenge-Test werden Zebrafischlarven in zwei 24-Brunnen-Platten mit jeweils einer Larven und einem Milliliter E3-Medium übertragen. Nach einer fünfminütigen Eingewöhnung in der Zebrabox aktivieren Sie den Online-Modus der Tracking-Analyse. Dann konfigurieren Sie das Lichtprogramm auf sechs Minuten konstantes Licht, gefolgt von vier Minuten völliger Dunkelheit.

In der 10. Minute stoppen Sie die Verhaltensaufzeichnung und speichern Sie die Daten. Nimm die Platte vorsichtig aus der Zebrabox. Nach jedem Verhaltensexperiment werden alle mit MPTP berührten Oberflächen mit frisch zubereiteter Natriumhypochloritlösung besprüht und abgewischt.

Sammeln Sie flüssige und feste Abfälle, die MPTP enthalten, und kennzeichnen Sie diese klar als gefährliche neurotoxische Abfälle. Behandeln Sie alle kontaminierten Materialien mit frisch hergestellter Natriumhypochloritlösung. Behandelte Zebrafischlarven zeigten im Vergleich zur Wildtyp-Gruppe gestörte Schlaf- und Wachaktivitätsspuren.

Die gesamte Schlafzeit war in der behandelten Gruppe ebenfalls signifikant erhöht. Die Anzahl der Sleepouts war in der behandelten Gruppe signifikant verringert, während die durchschnittliche Sleepout-Länge zunahm. Die Wachaktivität und durchschnittliche Aktivität waren in der behandelten Gruppe signifikant beeinträchtigt.

Bei konstantem Licht war der Gefrierindex der behandelten Gruppe signifikant erhöht. Auch unter Stroboskopstimulation bei 10 Hertz nahm sie deutlich zu. Fotomotorische Reaktionskurven zeigten eine verminderte Reaktivität in der behandelten Gruppe.

Die Tracking-Ergebnisse zeigten ein vermindertes Bewegungs- und Explorationsverhalten in der behandelten Gruppe. Das Gesamtschwimmen und die durchschnittliche Schwimmgeschwindigkeit wurden in der behandelten Gruppe ebenfalls signifikant reduziert. Das Bewegungszeitverhältnis war in der behandelten Gruppe signifikant höher, aber das Verhältnis der schnellen Bewegungszeit war deutlich niedriger.

Abwechselnde Licht- und Dunkelübergänge führten bei Wildtyplarven zu ausgeprägten Geschwindigkeitsspitzen. Die nach der Stimulation geschwommene Distanz und die Spitzengeschwindigkeit nach der Stimulation waren in der behandelten Gruppe signifikant verringert. Auch der Beginn der Latenz bis zur Spitzengeschwindigkeit war in der behandelten Gruppe deutlich verzögert.

Die Hauptherausforderung besteht darin, interne Determinanten zu minimieren und gleichzeitig individuelle Variabilität zu berücksichtigen, um eine genaue und reproduzierbare Verhaltensanalyse auf Zebrafischebene sicherzustellen. Verhaltensclustering und phänomisches Profiling können angewandt werden, um subtile neurotoxische Effekte aufzudecken und tiefere magnetische Einsichten zu gewinnen. Zukünftige Studien können diese Plattform für hazard-zugelassene Arzneimitteltests und die pharmakologische Bewertung in Zebrafisch-Parkinson-Modellen anwenden.