Metagenomische Next-Generation-Sequenzierung von Rückenmarksflüssigkeit zum Nachweis von Krankheitserregern des zentralen Nervensystems

Dies ist ein forschungsbasiertes Protokoll zur metagenomischen Next-Generation-Sequenzierung von Proben der Gehirnrückenmarksflüssigkeit, um den Nachweis potenzieller Krankheitserreger in der Probe zu ermöglichen. Bestehende MNGS-Protokolle berücksichtigen die geringe RNA-Ausbeute im CSF nicht. Dieses Protokoll optimiert mehrere Schritte, um die geringe Biomasse in diesen Proben zu berücksichtigen.

Um mit dem Auftauen der Liquorproben auf Eis zu beginnen, werden 100 Mikroliter auf einen Milliliter jeder Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen und bei 16.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Dann pipettieren Sie vorsichtig das Überstandsmittel ab, wobei das Pellet und 100 Mikroliter Überstandsmittel übrig bleiben. Fügen Sie 100 Mikroliter DNA-RNA-Schild zu den verbleibenden 100 Mikrolitern des Supernatants und Pellets hinzu und mischen Sie gründlich.

Anschließend werden 600 Mikroliter DNA-RNA-Lysepuffer hinzugefügt und durch Pipettieren vermischt, bis die Lösung homogen ist. Führen Sie das DNA- und RNA-Extraktionsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden wichtigen Änderungen durch. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte eine Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit durch, mit Ausnahme des abschließenden DNA-RNA-Washs, der drei Minuten zentrifugiert werden sollte.

Um die Probe zu elutieren, geben Sie 22 Mikroliter nukleasefreies Wasser direkt auf die Säulenmatrix. Dann drei Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubieren. Nach der Ellucian-Pipette den Fluss zurück in die Säulenmatrix zentrifugieren Sie erneut eine Minute mit Höchstgeschwindigkeit, bevor die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Speicherrohr umgeleitet wird.

Pipettieren Sie die für RNA-Fragmentierung und -Priming benötigten Komponenten in einem PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie das Rohr in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius. Die Pipette mischt die fragmentierte und primierte RNA mit acht Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und zwei Mikrolitern Erststrang-Synthese-Enzymmischung.

Inkubieren Sie das Rohr in einem Thermocycler mit einem beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius. Dann mischt man die erste synthetisierte DNA mit 48 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Acht Mikroliter Puffer für die Zweitstrangsynthese und vier Mikroliter Enzymmischung für die Synthese des zweiten Strangs.

Setzen Sie das Rohr in einen Thermocycler und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 16 Grad Celsius mit geschlossenem beheizten Deckel. Als Nächstes führen Sie eine magnetische Perlenreinigung mit einem 1,8-fachen Verhältnis von Festphasen-reversiblen Immobilisierungs-Magnetperlen durch. Elutieren Sie die Probe in 53 Mikroliter nukleasefreies Wasser.

Übertragen Sie 50 Mikroliter des endgültigen Supernatants mit gereinigtem doppelsträngigem CDNA in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr. An diesem Punkt können die Proben über Nacht bei minus 20 Grad Celsius eingefroren werden. Wenn die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurde, tauen Sie sie vor Neustart auf Eis auf.

Pipette mischt 50 Mikroliter gereinigtes doppelsträngiges CDNA mit sieben Mikrolitern Endvorbereitungsreaktionspuffer und drei Mikrolitern Endvorbereitungsenzymmischung. Bringen Sie die Proben in einen Thermocycler und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 20 Grad Celsius und 30 Minuten bei 65 Grad Celsius mit geschlossenem Deckel. Als Nächstes führen Sie den Adapterligationsschritt auf Eis durch, indem Sie zunächst eine Verdünnung des Adapters von eins bis 100 in nukleasefreiem Wasser erzeugen.

Pipettieren Sie das Endvorbereitungs-Reaktionsgemisch in ein Rohr mit 30 Mikrolitern Ligations-Mastermischung, einem Mikroliter Ligamentverstärker und 2,5 Mikrolitern dem verdünnten Adapter. Geben Sie die Proben in einen Thermocycler und inkubieren Sie bei 20 Grad Celsius für 15 Minuten mit geschlossenem beheizten Deckel. Danach wird sofort mit der magnetischen Perlenreinigung übergegangen, wobei ein 0,9-faches Verhältnis von Festphasen-reversiblen Immobilisierungs-Magnetperlen verwendet wird.

Dann elutieren Sie in 17 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Übertragen Sie 15 Mikroliter des finalen Supernatanten in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr. Jetzt hat der Pipette-Purified Adapter CDNA zu einem Rohr mit drei Mikrolitern Benutzerenzym, 25 Mikrolitern Q5-Mastermischung und 10 Mikrolitern einzigartigen barcodedierten Primern ligiert.

Setzen Sie das Rohr in einen Thermocycler mit einem beheizten Deckel auf 105 Grad Celsius und inkubieren Sie unter den angegebenen Bedingungen. Führen Sie eine abschließende magnetische Perlenreinigung mit einem 0,8-fachen Verhältnis der magnetischen Perlen durch. Anschließend elutieren Sie die Probe in 23 Mikroliter nukleasefreies Wasser.

Übertragen Sie 20 Mikroliter des finalen Supernatanten in ein sauberes, nukleasefreies PCR-Rohr. Quantifizieren Sie die Konzentration der Probenbibliotheken mit einem DNA-Quantifizierungskit und dem entsprechenden Fluorimeter. Überprüfen Sie, dass Wasserkontrollen deutlich niedrigere oder nicht quantifizierbare Konzentrationen im Vergleich zu den anderen Proben aufweisen.

Bewerten Sie die Größen der Probenbibliotheken, indem Sie die Proben auf einer automatisierten Kapillarelektrophorese-Maschine durchführen. Nutzen Sie die Open-Source-Webplattform Chan Zuckerberg ID, um metagenomische Analysen zur Pathogenerkennung durchzuführen. Melden Sie sich bei der Chan Zuckerberg ID an und klicken Sie auf Hochladen.

Wählen Sie Metagenomik als Analysetyp aus und wählen Sie die Eingabe-FASTQ-Dateien aus dem Sequenzierungslauf aus. Geben Sie die erforderlichen Probeninformationen ein, einschließlich Probenname, Probentyp, CSF und Nukleotid-Typ RNA oder DNA. Sobald die Verarbeitung abgeschlossen ist, klicken Sie auf den Projektordner mit den Beispielen und navigieren Sie zum Übersichts-Dashboard.

Scrollen Sie nach unten, um die Anzahl der Lesungen pro Stichprobe zu betrachten. Überprüfen Sie den Prozentsatz der Lesungen, die die Qualitätskontrollfilterung bestehen, sowie das doppelte Kompressionsverhältnis, um eine verzerrte PCR über Amplifikation zu beurteilen. Um eine Kontamination mit fremder DNA im Projektordner zu bestimmen, wählen Sie jede Wasserkontrollprobe aus und klicken Sie auf Hintergrundmodell, um das Modell zu erstellen.

Während der Analyse wenden Sie das Modell an und verwenden Sie Schwellenfilter, um einen NTZ-Wert höher als eins zu setzen, um wahrscheinliche Schadstoffe zu entfernen. Analysieren Sie dann die Daten mit geeigneter statistischer Software. Die Kapillarelektrophorese- und Elektropherogrammdaten zeigten eine CDNA-Sample-Bibliothek, die überfragmentiert war und Adapterdimere enthielt, die nicht für die Sequenzierung bestimmt waren.

Die CDNA-Bibliothek ohne erhebliche Adapter-Dimerkontamination war bereit für Pooling und Sequenzierung. Die CSF-Metagenom-Sequenzierung der nächsten Generation entdeckte verschiedene Krankheitserreger in Kohorte A und B, wobei mindestens ein Erreger in 73,5 % der Kohorte A-Proben und 51,2 % der Kohorte B-Proben vorhanden war. Eine zentrale Herausforderung ist das präzise Pipetteren aufgrund geringer Volumina sowie zeitkritischer B-Trocknung, bei der zu viel oder zu viel Trocknung die Ergebnisse beeinträchtigen kann.

Während dieses spezielle Protokoll auf die Pathogen-Nachweisseite ausgerichtet ist, können die durch dieses Protokoll erzeugten RNA-Transkripte des Wirts für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden. Daher ist es für zukünftige Studien wichtig, die Leistung dieses speziellen Bibliotheksvorbereitungs- und Sequenzierungsprotokolls mit neuen Methoden zu vergleichen, die auch für spärliche Proben entwickelt wurden, um zu sehen, wie es nicht nur bei der Pathogenerkennung, sondern auch bei transkriptomischen Analysen übereinstimmt.