Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren aus Mäusekot mittels einer zweiphasigen Säure-Lösungsmittel-Methode
17. Juli 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine zweiphasige Säure-Lösungsmittel-Extraktionsmethode zur Isolierung kurzkettiger Fettsäuren aus niedrig einbringenden Mauskotproben ohne Derivatisierung.
Dieses Protokoll ermöglicht die Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren oder SCFAs aus Kotproben mit niedrigem Input aus Mausfäkalien für routinemäßige Gaschromatographie-basierte Analysen. SCFAs wie Acetat, Propionat und Butyrat werden von der Darmmikrobiota durch die Fermentation von Ballaststoffen produziert. Sie werden vielfach untersucht, weil sie mit Verhaltens-, Stoffwechsel- und physiologischen Phänotypen assoziiert werden.
Die Quantifizierung von SCFAs in Stuhlproben bleibt jedoch eine Herausforderung. Diese Metaboliten sind flüchtig, oft in niedrigen Konzentrationen vorhanden und werden in komplexen biologischen Matrizen gemessen. Bei Mausstudien ist auch die Menge an Kotmaterial, die von jedem Tier gesammelt wird, oft begrenzt.
Standardverfahren erfordern möglicherweise Derivatisierung, relativ große Probenvolumina oder spezialisierte Ausrüstung. Hier wird ein Zweiphasen-Workflow zur Extraktion von Säurelösungsmitteln mit verdünnter Salzsäure und Ethylacetat für die Extraktion von SCFAs aus Stuhlproben mit geringem Input im Format präsentiert, das mit einer routinemäßigen GC-Analyse kompatibel ist. Also beginnen wir mit unserem richtigen Layout, um mit dem Rest unseres Protokolls fortzufahren.
Als Nächstes haben wir unsere Probenbox mit unseren gefrorenen Kotproben korrekt beschriftet. Als Nächstes stellen wir unsere 1000-Mikroliter-Pipette auf 255 ein. Jetzt haben wir unsere beschriftete HCl-Verdünnung.
Wir setzen die Zuweisung von HCl in jede unserer Proben fort. Jetzt geben wir Ethanol in unseren Reinigungsbrunnen für unsere Pinzette. Jetzt verwenden wir dasselbe Ethanol, um unser Bad für unsere Stößel herzustellen.
Jetzt nehmen wir unsere Kotproben und geben sie in die Zentrifugenphiole. Jetzt verwenden wir unsere sauberen Stößel, um jede Kotprobe in den jeweiligen Zentrifugenphiolen zu mahlen. Wir nehmen unsere Proben und legen sie mindestens 10 Sekunden lang oder bis sie vollständig vermischt sind, auf den Wirbel auf.
Wir bringen die gemischten Proben in unsere Zentrifuge und richten sie vor. Sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Ausbalancierung der Zentrifuge. Stellen Sie die Zentrifuge auf 16.000 Mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius ein.
Nach 10 Minuten entferne deine Proben aus der Zentrifuge. Beschrifte neue Zentrifugenphiolen entsprechend deinen Proben. Stellen Sie Ihre 200-Mikroliter-Pipette auf 120 ein.
Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu berühren. Übertragen Sie das Supernatant in Ihre neuen jeweiligen Fläschchen. Du kannst das Pellet wegwerfen.
Gib eine gleiche Menge Ethylacetat in deine neuen Fläschchen. Bringen Sie diese Proben zurück zur Zentrifuge. Stellen Sie die Zentrifuge auf 2.374 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius ein.
Nach 20 Minuten entferne deine Proben. Beschrifte neue Zentrifugenphiolen entsprechend deinen Proben. Stellen Sie Ihre Pipette wieder auf 120 Mikroliter ein.
Achte darauf, die unterste Schicht nicht zu berühren, und entferne nur die oberste Schicht. Übertragen Sie das Supernatant korrekt beschriftet in neue Fläschchen. Übertragen Sie diese Proben in Ihre Probenkiste zur Aufbewahrung bis zur weiteren Analyse.
Zum Schluss eine Probenbox in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius platzieren. Die extrahierten SCFA-Aliquoten, jeweils 120 Mikroliter, wurden bei minus 80 Grad Celsius gelagert, bevor sie mit Gaschromatographie quantifiziert wurden. Die quantitative Analyse identifizierte acht SCFAs, darunter die wichtigsten Metaboliten: Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, wie in der Abbildung gezeigt.
Zur Validierung der SCFA-Isolation wurden Gaschromatographiedaten mittels Rückgewinnungs- und Reproduzierbarkeitstests bewertet. Die Erholung wurde durch das Spitzen von Kontrollproben mit bekannten Konzentrationen des internen Standards bewertet, während die Reproduzierbarkeit durch wiederholte Analysen innerhalb und über Tage hinweg bestätigt wurde. Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen Workflow für die SCFA-Extraktion aus maus-Kotproben mit geringem Input.
Sie erfordert keine Derivatisierung und ist mit routinemäßiger GC-basierter Analyse kompatibel. Diese Methode kann die Messung des fäkalen SCFA in verschiedenen Mausmodellen unterstützen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) aus geringen Mengen an Mäusekotproben mittels einer zweiphasigen Säure-Lösungsmittel-Extraktionsmethode vor. Die Methode ist für kleine Probenmengen optimiert und kompatibel mit Standardlaborgeräten, wodurch eine effiziente Probenvorbereitung für die Analyse mittels Gaschromatographie ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Analytische Chemie
- Metabolomik
- Forschung zum Mikrobiom
Hintergrund
- SCFAs sind wichtige mikrobielle Metaboliten im Darm mit bedeutenden biologischen Funktionen.
- Die genaue Quantifizierung von SCFAs aus kleinen Stuhlproben ist in Studien an Kleintieren herausfordernd.
- Bestehende Extraktionsmethoden erfordern möglicherweise eine Derivatisierung oder große Probenmengen.
- Es besteht Bedarf an standardisierten, effizienten Protokollen, die mit routinemäßigen analytischen Arbeitsabläufen kompatibel sind.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Extraktion von SCFAs aus individuellen fäkalen Mausproben von 20–50 mg.
- Möglichmachung der Phasentrennung ohne Derivatisierung unter Verwendung verdünnter Salzsäure und Ethylacetat.
- Sicherstellung der Verträglichkeit mit der Analyse mittels Gaschromatographie.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Fäkalproben
- Versäuern mit verdünnter Salzsäure
- Phasentrennung mit Hilfe von Ethylacetat
- Zentrifugation bei niedriger Temperatur
- Verwendung gängiger Laborgeräte
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Extraktion der wichtigsten kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs: Acetat, Propionat, Butyrat) aus einzelnen Fäkalproben von Mäusen.
- Deutliche Auflösung der SCFA-Signale bei charakteristischen Retentionszeiten über dem Hintergrundrauschen hinaus.
- Das Protokoll eignet sich für Proben mit geringem Probenvolumen und ist kompatibel mit gängigen Gaschromatographie-Plattformen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet einen standardisierten Arbeitsablauf zur Extraktion von SCFAs aus begrenztem fäkalen Material.
- Es behebt prozedurale Herausforderungen bei Studien an Kleintieren.
- Die Methode ermöglicht eine zuverlässige nachgeschaltete SCFA-Analyse unter Verwendung gängiger Laborgeräte.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Extraktion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) aus geringen Mengen an Mäusekotproben behebt einen kritischen Engpass in der mikrobiomgetriebenen Forschung und präklinischen Metabolomik. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung von SCFAs mittels routinemäßiger Gaschromatographie und unterstützt translationsorientierte Studien, die Darmmikrobiota-Metaboliten mit der Wirtsbiologie verknüpfen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsforschung und erleichtert den Vergleich zwischen Studien innerhalb unternehmensweiter F&E-Portfolios.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine robuste Quantifizierung von im Darm gebildeten kurzkettigen Fettsäuren für hypothetisch orientierte Mikrobiomforschung.
- Unterstützt die funktionelle Validierung mikrobieller Stoffwechselwege in für Krankheiten relevante Modellen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung durch bereitstellung quantitativer Metabolitenmesswerte.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt standardisierte biologische Extrakte, die mit hochdurchsatzfähigen Gaschromatographie-Workflows kompatibel sind.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit von Assays an präklinischen Proben mit geringem Probenvolumen.
- Ermöglicht eine zuverlässige Untersuchung von Interventionen, die die Produktion von SCFAs modulieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung der Metabolitenquantifizierung mit translationalen Biomarker-Strategien in Kleintiermodellen.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von mikrobiomzielgerichteten Interventionen.
- Verringert das Risiko analytischer Variabilität in vergleichenden Studien und multizentrischen Forschungsprojekten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Extraktionsprotokoll ist in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase einzuordnen und ermöglicht die quantitative Analyse von SCFAs aus begrenztem biologischem Material sowie nachgeschaltete Biomarker- und Mechanismusstudien.
- Entdeckungsbioanalytik: Bietet einen standardisierten Workflow für Hypothesentests und die Untersuchung von Signalwegen in der Mikrobiomforschung.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative SCFA-Messungen, die für die Assay-Entwicklung und die Bewertung von Verbindungen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt klare chromatographische Peaks zur vergleichenden Analyse experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung präklinischer Metabolitendaten mit translationalen Biomarker-Zielen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein breit anwendbares Extraktionsverfahren für vielfältige Mikrobiom- und Metabolomik-Studien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Beziehungen zwischen Mikrobiom und Metaboliten sowie die Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Extraktion und Analyse über verschiedene Studien hinweg und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen für mikrobiomzielgerichtete Programme und verringert das analytische Risiko in späteren Entwicklungsphasen.
- Portfolioauswirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Entdeckungsansätzen, die auf Mikrobiom und Metaboliten basieren.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in der Probenhomogenisierung und Gaschromatographie-Analyse voraus.
- Kommt mit Standard-Laborausrüstung und routinemäßiger analytischer Infrastruktur aus.
- Erfordert die Einhaltung standardisierter Extraktions- und Analyseprotokolle durch alle beteiligten Arbeitsgruppen.
- Einsatzmöglichkeiten bei verschiedenen Kleintiermodellen und geringen Probenmengen.
- Die Extraktionseffizienz und die Nachweisgrenzen sind für jeden experimentellen Kontext zu validieren.
