RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode
30. April 2026
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.
Wir entwickelten die RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode, auch die RDD-Methode genannt, um den Chromatinkontakt zu kartieren, organisiert durch spezifische RNA-Moleküle. RDD kartiert RNA-spezifische Chromatinbandierung und Langstreckeninteraktionen über endogene und exogene RNAs robust. Zu Beginn wird das permeabilisierte Kernpellet, das von Drosophila S2 dual crosslinked Cells gewonnen wird, in 15 Millilitern 0,1 % FA-Lysepuffer mit Triton X-100 wieder suspendiert.
Aliquot 1,5 Milliliter der nuklearen Suspension in ein 14-Milliliter-Reagenzglas mit rundem Boden und dabei Blasenbildung vermeiden. Sonikieren Sie die Federung mit einer Amplitude von 38 % für 4,5 Minuten mit 30-Sekunden-Ein- und 30-Sekunden-Aus-Zyklen. Sammeln Sie das sonicierte Chromatin in ein 15-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie bei 3.200g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie etwa 13 Milliliter des Supernatanten in ein neues 15-Milliliter-Rohr. Gib nun 100 Mikroliter vorbereitete Streptavidin-C1-Perlen in das Rohr mit sonikiertem Chromatin und drehe es 20 Minuten bei Zimmertemperatur. Dann wird das Röhrchen für eine Minute auf ein magnetisches Gestell gelegt und das Supernatant mit dem vorfreigeräumten Chromatin in ein neues 50-Milliliter-Rohr übertragen.
Lagern Sie 10-Mikroliter-Aliquot bei minus 20 Grad Celsius zur Analyse. Inkubieren Sie 26 Milliliter frisch vorbereiteten Hybridisierungspuffer mit 13 Millilitern vorgeklärtem Chromatin auf einem Rotator für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Als Nächstes wird die Hybridisierungsmischung in drei 15-Milliliter-Röhren verteilt und sechs Mikroliter 100-mikromolare biotinylierte Sonden zu jeder Probe hinzugefügt.
Nachdem Sie die Röhrenkappen mit Film versiegelt haben, drehen Sie die Röhren über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach dem Blockieren der Streptavidin-C1-Perlen entfern Sie den Blockpuffer und setzen Sie die Perlen in 400 Mikroliter Hybridisierungspuffer wieder auf. Fügen Sie nun die blockingpuffer-behandelten Streptavidin-C1-Perlen dem zuvor hergestellten hybridisierten Chromatin hinzu.
Drehen Sie die Mischung 2,5 Stunden bei Zimmertemperatur. Nachdem Sie das Supernatant entsorgt und die Perlen in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen haben, waschen Sie die Perlen fünfmal mit 800 Mikrolitern Waschpuffer und dann zweimal mit TE-Puffer. Nach der letzten Wäsche entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Perlen bei Raumtemperatur in 1.000 Mikrolitern TE-Puffer mit 1x Proteaseinhibitor.
Um unbesetzte Stellen an den an den Sonden-Chromatin-Komplex gebundenen Streptavidin-C1-Perlen zu blockieren, geben Sie 220 Mikroliter denaturiertes IPB zu den Perlen und drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Nach der Inkubation werden die Streptavidin-C1-Perlen fünfmal mit TE-Puffer gewaschen. Als Nächstes geben Sie 693 Mikroliter End-Reparaturmischung zum Chromatin der Streptavidin-C1-Perlen und mischen Sie gut.
Dann fügen Sie sieben Mikroliter T4-DNA-Polymerase hinzu. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Thermomixer mit 800 Umdrehungen pro Minute und 12 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann inkubiert man die Probe 15 Minuten lang auf einem Mixer bei 16 Grad Celsius.
Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 Mikrolitern eiskaltem ChIA-PET-Puffer und dann einmal mit TE-Puffer. Dann gibt man 693 Mikroliter A-Tailing-Mischung zum Chromatin der Streptavidin-C1-Perlen und mischt gut. Als Nächstes fügen Sie sieben Mikroliter Klenow-Fragment drei Prime zu fünf prime Exonuklease minus hinzu.
Inkubieren Sie das Rohr auf einem Mischer mit 12 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 Mikrolitern eiskaltem ChIA-PET-Puffer und dann einmal mit Elutionspuffer durch sanftes Pipettern. Geben Sie nun 1.390 Mikroliter Proximity-Ligationsmischung zum Chromatin der Streptavidin-C1-Perlen und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf einem Mixer bei Raumtemperatur.
Fügen Sie 10 Mikroliter T4-DNA-Ligase zur Mischung hinzu und inkubieren Sie mit einer Rotation von 20 Umdrehungen pro Minute bei Zimmertemperatur für fünf Minuten, dann schalten Sie auf 12 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für 50 Minuten um und setzen die Inkubation über Nacht bei 16 Grad Celsius fort. Waschen Sie anschließend die Perlen dreimal mit 800 Mikrolitern eiskaltem ChIA-PET-Puffer und dann zweimal mit TE-Puffer. Für die Chromatinfreisetzung fügen Sie 480 Mikroliter LC ChIP-Elutionspuffer zum Chromatin auf Streptavidin-C1-Perlen hinzu und mischen Sie gut.
Fügen Sie 20 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K zur Entvernetzung hinzu. Inkubieren Sie das Rohr über Nacht auf einem Thermomixer mit 950 Umdrehungen pro Minute und 65 Grad Celsius und reinigen Sie dann die proximitätsligierte DNA mit einem Phenol:Chloroform:Isoamyl-Alkoholreagenz. Fügen Sie alle erforderlichen Komponenten für den Tn5-Tagmentationstest in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikrolitern in einem PCR-Röhrchen auf Eis hinzu.
Inkubieren Sie die Tagmentationsreaktion bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten in einem Thermocycler mit dem Deckel auf 70 Grad Celsius und halten Sie dann bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 50 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer und einen Mikroliter Proteinase K zur markierten DNA hinzu. Mische die Lösung und inkubiere sie auf einem Thermomixer bei 65 Grad Celsius und 900 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten.
Reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Reinigungskit und quantifizieren Sie die DNA mit einem automatischen Kapillarelektrophoresesystem. Fügen Sie alle fragmentierten ligierten DNA zu M280-Perlen hinzu, die mit Blockierungspuffer und genomischer DNA vorgeblockt sind, und mischen Sie die Suspension. Drehen Sie das Rohr auf einem Mixer bei Zimmertemperatur 45 Minuten lang.
Nach einer kurzen Drehung stellt man das Rohr auf ein magnetisches Gestell und entsorgt das Supernatant. Nach den Waschschritten geben Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen, ohne zu mischen. Bereiten Sie die PCR-Mischung gemäß dem DNA-Bibliotheks-Vorbereitungskit vor.
Übertragen Sie die PCR-Röhren auf eine PCR-Maschine und richten Sie das Verstärkerprogramm ein. Schließlich misst man nach der Reinigung des PCR-Produkts mit magnetischen Perlen 10 bis 30 Nanogramm Bibliotheks-DNA mit einem Nukleinsäurequantor, um die Probe für die Sequenzierung vorzubereiten. Sonicierte Chromatinfragmente reichten von etwa 1.000 bis 3.000 Basenpaaren, was auf eine erfolgreiche Fragmentierung hinweist.
RNA-assoziiertes Chromatin zeigte eine Fragmentgröße von etwa 1.000 bis 3.000 Basenpaaren. Mit Tn5 markierte Chromatin zeigte eine Fragmentverteilung, die auf die Effizienz der Chromatin-Tagmentation hinweist. Die Sequenzierungsbibliothek zeigte nach der Amplifikation eine Fragmentgrößenverteilung von etwa 180 bis 1.000 Basenpaaren.
Nach der Größenauswahl wurden die Sequenzbibliotheksfragmente überwiegend im Bereich von etwa 250 bis 600 Basenpaaren angereichert. Die RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktion, oder RDD-Methode, erkannte die genomischen Orte der NC-RNA-Bindung roX2 und 7SK sowie die entsprechenden entfernten Chromatin-Interaktionsschleifen. Daten aus RNA-Polymerase II ChIA-PET zeigen eine klare regulatorische Beziehung zwischen diesen NC-RNAs und der Genexpression, wobei Spitzen auf die Interaktionsstärke hinweisen.
Die multidimensionale Analyse wurde erreicht, indem RDD-verankerte Interaktionen mit Hi-C-genomweiten Chromatin-Konformationskarten und epigenomischen Markierungen, entstehender Transkription und RNA-Polymerase-II-ChIA-PET-Daten integriert wurden. In diesen Regionen wurden topologisch assoziierende Domänen klar visualisiert, wobei RNA-geführte Chromatinschleifen oft an ihren Grenzen oder über mehrere solcher Domänen liegen. Zusätzlich wurden die RNA-zentrierten regulatorischen Hubs bestimmt.
RDD-Methode und verankerte Chromatin-Interaktionen, die RNA-Bindungsstellen und assoziierte DNA-DNA-Interaktionen in der Organisation des 3D-Genoms offenbaren. Wichtige Lehren sind die Aufrechterhaltung korrekter Probe-, Linker- und Chromatinverhältnisse sowie das Blockieren unbegrenzter Streptavidinstellen mit dem natürlichen Biotin vor der Polymerase-Ligation. Zukünftige Studien können untersuchen, wie RNA Chromatinwechselwirkungen dynamisch über Entwicklung, Störungen und Infektionen hinweg bewegt.
Overview
The RNA-Associated Chromatin DNA-DNA Interaction Method (RDD) is a targeted approach for mapping chromatin interactions anchored by specific RNAs. This technique enables simultaneous identification of genomic loci associated with a target RNA and the resolution of long-range DNA-DNA contacts among these loci, providing insights into spatial genome organization and regulatory mechanisms.
Key Study Components
Area of Science
- Genomics
- Epigenetics
- Molecular Biology
Background
- Chromatin interactions play a crucial role in gene regulation and genome architecture.
- RNAs, including coding and non-coding types, can organize chromatin and influence gene expression.
- Existing methods often lack the ability to map chromatin interactions specifically anchored by RNAs.
- Understanding RNA-mediated chromatin organization is essential for dissecting regulatory networks.
Purpose of Study
- To develop a robust method for mapping chromatin interactions anchored by specific RNAs.
- To enable high-resolution identification of RNA-associated genomic loci and their spatial contacts.
- To facilitate the study of enhancer-promoter pairing and long-range gene regulation mediated by RNAs.
Methods Used
- Use of biotinylated antisense probes complementary to the target RNA for enrichment of RNA-chromatin complexes.
- Cell crosslinking, chromatin fragmentation, and end-repair.
- Proximity ligation using a designed linker to join spatially adjacent DNA fragments within captured complexes.
- Purification of ligation products, sequencing library preparation, and high-throughput sequencing.
- Bioinformatic analysis to generate RNA-anchored chromatin interaction maps.
Main Results
- RDD enables locus-specific, high-resolution mapping of chromatin contacts anchored by RNAs.
- The method is applicable to both endogenous and exogenous RNAs, including those from viruses and microorganisms.
- RDD is compatible with diverse cell types and experimental conditions.
- The workflow is robust and reproducible, yielding detailed contact profiles for regulatory studies.
Conclusions
- RDD provides a powerful tool for dissecting the three-dimensional genome architecture associated with regulatory RNAs.
- The method advances understanding of how RNAs organize chromatin and regulate gene expression.
- RDD is broadly applicable for studying enhancer-promoter interactions and long-range genomic regulation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
The RNA-Associated Chromatin DNA-DNA Interaction Method (RDD) enables biopharma R&D teams to map chromatin interactions anchored by specific RNAs, providing high-resolution insight into regulatory genome architecture. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at early discovery and preclinical inflection points, especially for RNA-mediated regulatory pathways. RDD's compatibility with diverse cell types and both endogenous and exogenous RNAs enhances its portfolio relevance for complex disease models and host-pathogen studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA-mediated regulatory mechanisms and spatial genome organization.
- Supports functional target validation by mapping RNA-associated chromatin contacts.
- Facilitates mechanistic de-risking for RNA and chromatin-modifying targets.
- Provides locus-specific data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromatin interaction maps for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative contact profiles for assay standardization.
- Enables platform reuse across coding and non-coding RNA targets.
- Supports reliable evaluation of compounds affecting RNA-chromatin interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by mapping regulatory RNA interactions in diverse cell types.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-mediated pathways.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for RNA-targeted therapeutics.
- Supports biomarker identification through high-resolution chromatin contact profiling.
Pipeline & Workflow Integration
RDD integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target identification and translational research.
- Discovery Biology: Reveals RNA-anchored chromatin interactions to clarify regulatory pathways and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides quantitative, reproducible contact maps for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates high-resolution sequencing data for comparative analysis of chromatin contacts across conditions.
- Translational Research: Enables mapping of disease-relevant RNA interactions in primary or model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, adaptable workflow for diverse RNA and chromatin research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-mediated regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible chromatin interaction mapping.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of RNA and chromatin-modifying targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, RNA biochemistry, and next-generation sequencing.
- Needs access to high-throughput sequencing and bioinformatics infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe design and data analysis.
- Adaptable to various cell types and experimental conditions with protocol optimization.
- Dependent on probe specificity and sequencing depth for resolution and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:25
Chromatin Fragmentation and Preclearing with Streptavidin C1 Beads
1:51
Chromatin-RNA Probe Hybridization and Immobilization on Streptavidin C1 Beads
3:42
On-Bead Chromatin End-Repair and A-Tailing
4:59
Chromatin Proximity Ligation and Release from the Streptavidin C1 Beads
6:22
Tn5 Tagmentation of Proximity-Ligated DNA
7:19
Immobilization and PCR Amplification of Ligated DNA on M280 Beads
8:23
Results
10:18
Conclusion
