Name: Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung, Aktivierung und transiente mRNA-Elektroporation primärer menschlicher T-Zellen zur CAR-T-Zell-Forschung. Dieses Protokoll ermöglicht die schnelle Bewertung verschiedener CAR-Konstrukte in vitro.

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<ol><li>Bartelt, R. R., Cruz-Orcutt, N., Collins, M., Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T+cell+receptor-induced+proximal+signaling+and+downstream+functions+in+immortalized+and+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of T cell receptor-induced proximal signaling and downstream functions in immortalized and primary T cells.</a> PLoS One. 4 (5), e5430(2009).</li>
<li>Smeets, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+profiling+of+T+lymphocyte+signal+transduction+pathways%3B+Th1+and+Th2+genomic+fingerprints+are+defined+by+TCR+and+CD28-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway profiling of T lymphocyte signal transduction pathways; Th1 and Th2 genomic fingerprints are defined by TCR and CD28-mediated signaling.</a> BMC Immunol. 13 (12), (2012).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jurkat+T-cell+lines+exhibit+marked+genomic+instability+affecting+karyotype%2C+mutational+profile%2C+gene+expression%2C+immunophenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Jurkat T-cell lines exhibit marked genomic instability affecting karyotype, mutational profile, gene expression, immunophenotype and function.</a> Sci Rep. 15 (1), 22426(2025).</li>
<li>Dobersberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineering+strategy+to+target+activated+EGFR+with+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">An engineering strategy to target activated EGFR with CAR T cells.</a> Cell Rep Methods. 4 (4), 100728(2024).</li>
<li>Van Bruggen, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lymphocytic+leukemia+cells+impair+mitochondrial+fitness+in+CD8%2B+T+cells+and+impede+CAR+T-cell+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8+ T cells and impede CAR T-cell efficacy.</a> Blood. 134 (1), 44-58 (2019).</li>
<li>Hoffmann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+expansion+potential+of+naive+chimeric+antigen+receptor+T+cells+from+healthy+donors+and+untreated+chronic+lymphocytic+leukemia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differences in expansion potential of naive chimeric antigen receptor T cells from healthy donors and untreated chronic lymphocytic leukemia patients.</a> Front Immunol. 8 (1956), (2017).</li>
<li>Zhang, D. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+CAR-T+cell+functionality+in+a+patient-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner.</a> Nat Commun. 14 (1), 506(2023).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> J Transl Med. 8 (104), (2010).</li>
<li>Xu, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+comparative+analysis+reveals+differential+impacts+of+various+cytokines+on+CART+cell+phenotype+and+function+ex+vivo+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo.</a> Oncotarget. 7 (50), 82354-82368 (2016).</li>
<li>Cornish, G. H., Sinclair, L. V., Cantrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-cell+growth+by+IL-2+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-cell growth by IL-2 and IL-15.</a> Blood. 108 (2), 600-608 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Foster, J. B., Barrett, D. M., Kariko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+in+vitro-transcribed+mRNA+in+adoptive+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">The emerging role of in vitro-transcribed mRNA in adoptive T cell immunotherapy.</a> Mol Ther. 27 (4), 747-756 (2019).</li>
<li>Becker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+effectiveness+of+gammadelta+T+cells+by+mRNA+transfection+of+chimeric+antigen+receptors+or+bispecific+T+cell+engagers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Enhancing the effectiveness of gammadelta T cells by mRNA transfection of chimeric antigen receptors or bispecific T cell engagers.</a> Mol Ther Oncolytics. 29, 145-157 (2023).</li>
<li>Wiesinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-scale+production+of+CAR-T+cells+for+the+treatment+of+melanoma+patients+by+mRNA+transfection+of+a+CSPG4-specific+CAR+under+full+GMP+compliance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Clinical-scale production of CAR-T cells for the treatment of melanoma patients by mRNA transfection of a CSPG4-specific CAR under full GMP compliance.</a> Cancers (Basel). 11 (8), 1198(2019).</li>
<li>Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+meets+mRNA+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy meets mRNA technology.</a> Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).</li>
<li>Sahin, U., Kariko, K., Tureci, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-based+therapeutics--developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Underwood, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activators+exhibit+distinct+downstream+effects+on+chimeric+antigen+receptor+T+cell+phenotype+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunohorizons%22%5BJournal%5D)">T cell activators exhibit distinct downstream effects on chimeric antigen receptor T cell phenotype and function.</a> Immunohorizons. 8 (6), 404-414 (2024).</li>
<li>Zajc, C. U., Teufl, M., Traxlmayr, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+stability+analysis+of+yeast+displayed+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Affinity and stability analysis of yeast displayed proteins.</a> Methods Mol Biol. 2491, 155-173 (2022).</li>
<li>Seigner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+mystery+of+the+FMC63-CD19+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Solving the mystery of the FMC63-CD19 affinity.</a> Sci Rep. 13 (1), 23024(2023).</li>
<li>Jalkanen, A. L., Coleman, S. J., Wilusz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+and+implications+of+mRNA+poly%28A%29+tail+size--does+this+protein+make+my+tail+look+big%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Determinants and implications of mRNA poly(A) tail size--does this protein make my tail look big.</a> Semin Cell Dev Biol. 34, 24-32 (2014).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+encoding+a+chimeric+antigen+receptor+is+critical+for+the+generation+of+a+robust+T-Cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA encoding a chimeric antigen receptor is critical for the generation of a robust T-Cell response.</a> Hum Gene Ther. 30 (2), 168-178 (2019).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-mRNA+for+transient+CAR+T+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal chimeric antigen receptor (CAR)-mRNA for transient CAR T cell generation.</a> Int J Mol Sci. 26 (3), 965(2025).</li>
<li>Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+assays+to+measure+CAR+T-cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonviral+approach+to+generate+transient+chimeric+antigen+receptor+T+cells+using+mRNA+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A nonviral approach to generate transient chimeric antigen receptor T cells using mRNA for cancer immunotherapy.</a> J Vis Exp. (216), e67548(2025).</li>
<li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+mRNA+CAR+T+cells+targeting+GD2+provide+dose-adjusted+efficacy+against+diffuse+midline+glioma+and+high+grade+glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Transient mRNA CAR T cells targeting GD2 provide dose-adjusted efficacy against diffuse midline glioma and high grade glioma models.</a> Neuro Oncol. 27 (10), 2684-2696 (2025).</li>
<li>Usheva, Z. I., Petersen, D. L., Barington, T., Mouritzen, P., Barnkob, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+cytotoxicity+assay+to+assess+chimeric+antigen+receptor+T+cells+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Droplet-based cytotoxicity assay to assess chimeric antigen receptor T cells at the single-cell level.</a> J Vis Exp. (217), e67657(2025).</li>
<li>Subham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+cytotoxicity+evaluation+of+Jurkat+expressing+chimeric+antigen+receptor+using+fluorescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro cytotoxicity evaluation of Jurkat expressing chimeric antigen receptor using fluorescent imaging.</a> J Vis Exp. (200), e65560(2023).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transfection+of+primary+human+and+mouse+T+lymphocytes+using+RNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transfection of primary human and mouse T lymphocytes using RNA electroporation.</a> Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Clausen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+the+activation-associated+receptors+CD25+and+CD69+on+human+NK-cells+and+NK-like+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of the activation-associated receptors CD25 and CD69 on human NK-cells and NK-like T-cells.</a> Immunobiology. 207 (2), 85-93 (2003).</li>
<li>Poloni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation-induced+marker+assays+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation-induced marker assays in health and disease.</a> Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).</li>
<li>Rotta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+flow+cytometry+immunophenotyping+of+human+antigen-specific+T+cells+by+activation-induced+marker+and+Th1+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for flow cytometry immunophenotyping of human antigen-specific T cells by activation-induced marker and Th1 cytokine detection.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103343(2025).</li>
<li>Elsallab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+primary+malignancies+after+commercial+CAR+T-cell+therapy%3A+analysis+of+the+FDA+adverse+events+reporting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Second primary malignancies after commercial CAR T-cell therapy: analysis of the FDA adverse events reporting system.</a> Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).</li>
<li>Verdun, N., Marks, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+cancers+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Secondary cancers after chimeric antigen receptor T-cell therapy.</a> N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).</li>
<li>Krug, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+activity+of+MCSP-specific+chimeric+antigen+receptors+%28CARs%29+depend+on+the+scFv+antigen-binding+domain+and+the+protein+backbone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Stability and activity of MCSP-specific chimeric antigen receptors (CARs) depend on the scFv antigen-binding domain and the protein backbone.</a> Cancer Immunol Immunother. 64 (12), 1623-1635 (2015).</li>
<li>Kitte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+outperform+electroporation+in+mRNA-based+CAR+T+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles outperform electroporation in mRNA-based CAR T cell engineering.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101139(2023).</li>
<li>Sauerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mRNA+as+a+universal+technology+platform+to+transfect+a+variety+of+primary+cells+with+antigens+and+functional+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mRNA as a universal technology platform to transfect a variety of primary cells with antigens and functional proteins.</a> Methods Mol Biol. 2786, 219-235 (2024).</li>
<li>Bimbo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-specific+non-viral+DNA+delivery+and+in+vivo+CAR-T+generation+using+targeted+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles.</a> J Immunother Cancer. 13 (7), (2025).</li>
<li>Hudecek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+non-viral%3A+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+breaks+on+through+to+the+clinical+side%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 52 (4), 355-380 (2017).</li>
<li>Prommersberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircles+for+CAR+T+cell+production+by+sleeping+beauty+transposition%3A+a+technological+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Minicircles for CAR T cell production by sleeping beauty transposition: a technological overview.</a> Methods Mol Biol. 2521, 25-39 (2022).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum Mol Genet. 20 (R1), R14-R20 (2011).</li>
<li>Soundara Rajan, T., Gugliandolo, A., Bramanti, P., Mazzon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-Transcribed+mRNA+chimeric+antigen+receptor+T+cell+%28IVT+mRNA+CAR+T%29+therapy+in+hematologic+and+solid+tumor+management%3A+A+preclinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro-Transcribed mRNA chimeric antigen receptor T cell (IVT mRNA CAR T) therapy in hematologic and solid tumor management: A preclinical update.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).</li>
<li>Granit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+clinical+activity+of+autologous+RNA+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+in+myasthenia+gravis+%28MG-001%29%3A+a+prospective%2C+multicentre%2C+open-label%2C+non-randomised+phase+1b%2F2a+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Safety and clinical activity of autologous RNA chimeric antigen receptor T-cell therapy in myasthenia gravis (MG-001): a prospective, multicentre, open-label, non-randomised phase 1b/2a study.</a> Lancet Neurol. 22 (7), 578-590 (2023).</li>
<li>Dagher, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+efficacy+of+multi-targeting+mRNA-based+CAR+T+cell+therapy+in+resection+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Preclinical efficacy of multi-targeting mRNA-based CAR T cell therapy in resection models of glioblastoma.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 36 (3), 102676(2025).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes, High Performance</td><td>VWR</td><td>525-1164</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates, flat bottom, TC-treated</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates, flat bottom, TC-treated&nbsp;</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD staining solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-568</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag DYKDDDDK Antibody, APC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-119-584</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Clinical Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Merck</td><td>A4503-10G</td><td>Für die Isolation durch Schwerkraft</td></tr><tr><td>CD134 (OX40) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-048</td><td>Konjugat: PE</td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-764</td><td>Konjugat: APC</td></tr><tr><td>CD154 (CD40L) Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-142</td><td>Konjugat: PerCP-VIO 700</td></tr><tr><td>CD25 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-114-541</td><td>Konjugat: PE-Vio 770</td></tr><tr><td>CD3 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-352</td><td>Konjugat: PE-Vio 670</td></tr><tr><td>CD4 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-223</td><td>Konjugat: APC-Vio 770</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Für die Isolation durch Schwerkraft</td></tr><tr><td>CD45 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-775</td><td>Konjugat: VioBlue</td></tr><tr><td>CD45RA Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-132-270</td><td>Konjugat: Vio Bright V600</td></tr><tr><td>CD62L Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-499</td><td>Konjugat: Vio Bright R720</td></tr><tr><td>CD69 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-800</td><td>Konjugat: VioGreen</td></tr><tr><td>CD8 Antibody, anti-human, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-677</td><td>Konjugat: FITC</td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td>Für die Isolation durch Schwerkraft</td></tr><tr><td>Cellstar 96 Well Suspension Culture Plate, U-bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650 185</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator ICO150</td><td>Memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>CoolNat Ice Machine</td><td>Ziegra Eismaschinen GmbH</td><td>ZBE 30-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning CoolCell Freezer Container</td><td>Corning</td><td>CLS432000</td><td></td></tr><tr><td>Counting chamber, Bürker-Türk pattern, BLAUBRAND</td><td>Brand</td><td>719520</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure tubes, 2 mL, QuickSeal screw cap</td><td>Sarstedt</td><td>72.380</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX LX Flow Cytometer</td><td>Beckmann Coulter</td><td>C11185</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) Cell culture grade</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes with 4 mm gap size, yellow cap</td><td>VWR</td><td>732-1137</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 0.1&ndash;2.5 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 100&ndash;1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 2&ndash;20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette, 20&ndash;200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Merck</td><td>E6758-100G</td><td>Für die Isolation durch Schwerkraft</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL PP Centrifuge Tube, Conical Bottom</td><td>Corning</td><td>325098</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Value FBS</td><td>Gibco</td><td>A52567-01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375-10G</td><td>Für die Isolation durch Dichtegradienten</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Sterile Graduated Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13469108</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td>mit PC Module und CE Module</td></tr><tr><td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing)</td><td>New England Biolabs</td><td>E2060S</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-15, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-955</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-7, research grade</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-367</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp;PIPETBOY acu 2 pipet aid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085685</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Für die Isolation durch Schwerkraft</td></tr><tr><td>Microplate, 96 well, PS, V-bottom, clear, non-binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651901</td><td></td></tr><tr><td>Monarch RNA Cleanup Kit (50 &mu;g)</td><td>New England Biolabs</td><td>T2040S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Spin PCR &amp; DNA Cleanup Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>

isolierung, kultivierung und vorübergehende transfektion primärer menschlicher t-zellen zur bildung von chimerischen antigenrezeptoren (car) t-zellen

Isolation, Cultivation, and Transient Transfection of Primary Human T Cells to Generate Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Aktivierung und Expansion primärer menschlicher T-Zellen Primäre T-Zellen wurden am Tag 0 aufgetaut und aktiviert, entweder mit CD3/28-Perlen oder TransAct, für 23 Tage erweitert und alle 2–3 Tage gezählt (Abbildung 2A). An Zähltagen wurden die Zelldichten auf 0,3–0,5 x 106 Zellen/ml angepasst. An den Tagen 0/2/5/9/14/20 wurden T-Zellen für die Flowzytometrie verwendet, um den Phänotyp und die Expression der Aktivierungsmarker zu bewerten. Innerhalb der ersten Woche nach der Aktivierung proliferierten und expandierten T-Zellen schnell mit beiden Aktivierungsreagenzien (Abbildung 2B), mit einer etwas geringeren Faltenausdehnung in den folgenden Tagen für T-Zellen, die durch TransAct aktiviert wurden (Abbildung 2C). Bemerkenswert ist, dass die Aktivierung von T-Zellen auch durch mikroskopische Analyse sichtbar war, wobei sich T-Cell-Cluster um die Aktivierungsreagenzien bildeten (Abbildung 2D).
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Aktivierung und Expansion primärer T-Zellen mit zwei verschiedenen Aktivierungsreagenzien. (A) Schematische Darstellung der experimentellen Zeitlinie. Die Zellen wurden entweder mit CD3/28-Perlen oder TransAct am Tag 0 aktiviert und 23 Tage lang kultiviert. Blaue Punkte zeigen die Tage, an denen die Zellen gezählt wurden, rote Punkte zeigen Tage, an denen die Zellen durch Flusszytometrie analysiert wurden, und violette Punkte Tage an, an denen beide Analysen durchgeführt wurden. (B) und (C) Expansion der primären T-Zellen während (B) der ersten Woche oder (C) innerhalb von 16 Tagen nach der Kultur. Die Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung von 4 (CD3/28-Perlen) oder 3 (TransAct) verschiedenen gesunden T-Zellspendern. (D) Repräsentative mikroskopische Bilder aktivierter T-Zellen mit sichtbarer Zellclusterbildung an den Tagen 1 und 2 nach der Aktivierung. Die Bilder wurden mit einem umgekehrten Mikroskop aufgenommen. Das Lineal entspricht 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Färbung des T-Zell-Phänotyps und der Aktivierungsmarker Für die Durchflusszytometrie wurde folgende Gating-Strategie angewandt (Abbildung 3): Ein erstes Gate (FSC-Höhe vs. SSC-Höhe) wurde angewendet, um Zellreste und -perlen zu entfernen, gefolgt von Gating für einzelne Zellen (FSC-Breite vs. SSC-Fläche). Der Anteil der CD3+- Zellen sollte im Bereich von 98-100 % liegen. Das weitere Subgating ergab den Prozentsatz der CD4+ (Helfer-)T-Zellen und CD8+ (zytotoxische) T-Zellen, die für verschiedene phänotypische T-Zell-Subsets unter Verwendung der Marker CD45RA und CD62L weiter gegat wurden. CD3+ T-Zellen wurden zusätzlich auf die Expression von Aktivierungsmarkern analysiert (CD25/CD69/CD134/CD137/CD154).
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie. Repräsentative Punktdiagramme eines T-Zellspenders, der mit CD3/28-Perlen am Tag 5 aktiviert wurde, sind dargestellt (n = 4). Abkürzungen; TEMRA = T-Effektor-Speicherzellen, die CD45RA neu ausdrücken; TSCM = stammzellähnliche Gedächtnis-T-Zellen; TEM = Effektorspeicher-T-Zellen; TCM = zentrale Speicher-T-Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Nach der Aktivierung mit CD3/28-Perlen nahm der Anteil der CD4+ -T-Zellen im Vergleich zu CD8+ -T-Zellen im Laufe der Zeit ab, mit 74,3 % (± 7,4 %) der CD4+- T-Zellen am Tag 5, die auf 14,6 % (± 3,4 %) am Tag 20 nach der Aktivierung sanken. Die CD8+ T-Zellen stiegen von 20,7 % (± 6,4 %) am Tag 5 auf 82,4 % (± 3,1 %) am Tag 20 (Abbildung 4A). Ähnliche Trends wurden nach der Aktivierung mit TransAct festgestellt, mit leicht niedrigeren Anteilen an CD8+ T-Zellen am Tag 20 (72,5 % ± 0,7 %). Daher entsprach die etwas langsamere T-Zell-Expansion, die nach der Aktivierung mit TransAct beobachtet wurde, einem geringeren Anteil an CD8+ und einem höheren Anteil an CD4+- Zellen während der Expansionsphase. Die Unterschiede in der phänotypischen Zusammensetzung der T-Zellen waren bei beiden Aktivierungsreagenzien ähnlich (Abbildung 4B). Allerdings waren die Frequenzen von T-Effektor-Gedächtniszellen, die CD45RA (TEMRA) reexprimieren, insgesamt höher bei CD8+- Zellen als bei CD4+- Zellen. Gleichzeitig zeigten CD4+ T-Zellen höhere Anteile an zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM) und stammzellähnlichen Gedächtnis-T-Zellen (TSCM) (Abbildung 4B).
CD134 war der einzige Aktivierungsmarker, der nach dem Auftauen der T-Zellen bereits hochreguliert war, mit 37,6 % (± 4,1 %) CD134+ T-Zellen, die mit CD3/28-Perlen aktiviert wurden, und 36,1 % (±4,4 %) CD134+ T-Zellen für TransAct-aktivierte T-Zellen (Abbildung 4C). In beiden Aktivierungsstrategien waren CD25, CD69 und CD134 bis Tag 2 stark hochreguliert. Bei CD3/28-Perlen erreichte die Expression von CD69 und CD134 ihren Höhepunkt am Tag 2, während CD25 am Tag 5 ihren Höhepunkt erreichte. Ähnliche Ergebnisse wurden für TransAct-aktivierte T-Zellen beobachtet. CD134 und CD154 wurden nur am Tag 14 für CD3/28-Perlen und TransAct-aktivierte Zellen hochreguliert. Insgesamt waren die beobachteten Trends zwischen den beiden Aktivierungsreagenzien sehr ähnlich. Die CD69-Expression am Tag 14 war jedoch in CD3/28-aktivierten T-Zellen etwas höher als bei den TransAct-Pendants (97,1 % ± 0,9 % gegenüber 86,5 % ± 5,1 %). Dies entspricht der anhaltend hohen Expansionsrate, die bei CD3/28-perlenaktivierten Zellen beobachtet wird. Zusammenfassend umfasst das vorgeschlagene Aktivierungsmarker-Panel Marker, die sowohl zu frühen als auch zu späteren Zeitpunkten nach der Aktivierung hochreguliert werden, mit unterschiedlicher Sensitivität zwischen den verschiedenen Aktivierungsmarkern, insgesamt aber ähnlichen Trends für beide Aktivierungsreagenzien.
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Analyse des T-Zell-Phänotyps und der Aktivierungsmarkerexpression mit verschiedenen Aktivierungsreagenzien während einer Kultivierungsphase von 20 Tagen. (A) Prozentsätze der CD4+/CD8+ T-Zellen während der Kultivierung nach Aktivierung mit CD3/28-Perlen (links) oder TransAct (rechts). (B) T-Zell-Differenzierung nach Aktivierung mit CD3/28-Perlen (zwei linke Panels) oder TransAct (zwei rechte Panels), jeweils für CD4+- oder CD8+-Zellen. Der Phänotyp wurde mit den Markern CD45RA und CD62L bewertet. TEMRA: CD45RA+ CD62L-, TEM: CD45RA-CD62L-, TCM: CD45RA-CD62L+, TSCM: CD45RA+ CD62L+. (C) Expression von Aktivierungsmarkern nach der Aktivierung mit CD3/28-Perlen oder TransAct und während der Ausdehnungsphase. Häufigkeiten [%] der CD3+ T-Zellen der Elternpopulation werden gezeigt (Mittelwert ± Standardabweichung von 4 [CD3/28-Perlen] oder 3 [TransAct] verschiedenen gesunden T-Zellspendern). Abkürzungen; TEMRA = T-Effektor-Speicherzellen, die CD45RA neu ausdrücken; TSCM = stammzellähnliche Gedächtnis-T-Zellen; TEM = Effektorspeicher-T-Zellen; TCM = zentrale Speicher-T-Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Transiente Transfektion primärer T-Zellen und Analyse der CAR-Expression Primäre T-Zellen wurden am 7. Tag nach der Aktivierung mit entweder CD3/28-Perlen oder TransAct durch Elektroporation mit mRNA transfektiert. Als Vorlage wurde eine mRNA verwendet, die für eine zweite Generation CAR codiert, die auf Chondroitinsulfat-Proteoglycan 4 (CSPG4) mit einem CD28-Costimulatorium und einer CD3ζ-Signaldomäne abzielt. Ein DYKDDDDK-Tag (Flag-Tag) wurde eingebaut, um eine durchflusszytometrische Detektion zu ermöglichen. Die T-Zell-Viabilität und die CAR-Expression wurden 3, 6, 24 und 48 Stunden nach der Elektroporation bewertet. Die Färbung wurde wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben durchgeführt.
Obwohl die Lebensfähigkeit sowohl der CD3/28-Perlen- als auch der TransAct-aktivierten T-Zellen 3 Stunden nach der Elektroporation niedrig war, lag die Lebensfähigkeit der transfektierten CAR-T-Zellen insgesamt zwischen 51 und 85 % und unterschied sich zwischen den beiden Aktivierungsstrategien nicht signifikant (Abbildung 5A). Das CAR war zu diesem frühen Zeitpunkt nach der Elektroporation bereits nachweisbar. Obwohl der Anteil der CAR+- Zellen im Laufe der Zeit allmählich abnahm, war die höchste Frequenz von CAR+- Zellen innerhalb von 24 Stunden nach der Elektroporation nachweisbar (Abbildung 5B, linkes Panel). Bemerkenswert ist, dass die Signalintensität innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Elektroporation stabil war und danach allmählich abnahm (Abbildung 5B, rechtes Panel). Die CAR-Expression war nach 48 Stunden fast nicht mehr vorhanden, was die vorübergehende Natur der Zellmanipulation und die Bedeutung der Wahl eines frühen Zeitfensters für nachgelagerte Assays zeigt. Repräsentative Punktdiagramme für die CAR-Expression eines Spenders sind in Abbildung 5C dargestellt. Für beide Aktivierungsreagenzien unterschied sich das CD4/CD8-Verhältnis nicht zwischen CAR- und MOCK-transfektierten Zellen (Abbildung 5D). Im Einklang mit unseren bisherigen Ergebnissen zeigten aktivierte T-Zellen mit CD3/28-Perlen eine etwas höhere Häufigkeit von CD8+- T-Zellen als Zellen, die mit TransAct aktiviert wurden. Für die phänotypische Analyse wird aufgrund großer spenderabhängiger Variationen ein repräsentativer Spender gezeigt (Abbildung 5E). Während sowohl das Aktivierungsreagenz als auch der CD4/CD8-Zustand den T-Zell-Phänotyp beeinflussen, verursacht die CAR-Expression im Vergleich zu MOCK-transfektierten Zellen keine Veränderung des Phänotyps.
Um den Einfluss der mRNA-Konzentration auf das Expressionsniveau zu bewerten, wurden primäre T-Zellen mit mRNA transfektiert, die für eine mutierte GFP-Version (muGFP) kodiert, wobei 0,1, 0,3, 1, 3 oder 6 μg mRNA verwendet wurden. Das GFP-Signal wurde 24 Stunden nach der Elektroporation mittels Durchflusszytometrie gemessen. Wie erwartet führten bereits so geringe Mengen mRNA wie 0,1 μg zu einem nachweisbaren GFP-Signal, mit einer allmählichen Erhöhung der Signalintensität und zunehmender mRNA-Mengen. In unseren Experimenten war bereits 1 μg mRNA gesättigt, und größere Mengen (3 und 6 μg mRNA) führten nicht zu einem erhöhten GFP-Signal (Abbildung 5F). Dies unterstreicht die Möglichkeit, unterschiedliche Mengen mRNA zur Titrierung der Expressionsniveaus zu verwenden, was vorteilhaft sein kann, um den Einfluss verschiedener CAR- oder sogar Zielantigenexpressionsniveaus28 zu testen.
<img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70162/70162fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Abbildung 5: Expressionskinetik von CARs und Phänotypanalyse transfizierter CAR-T-Zellen. (A) Lebensfähigkeit von CAR-T-Zellen nach Elektroporation mit CAR-codierender mRNA. 2 μL 7-AAD in 100 μL Färbepuffer wurden verwendet, um die Viabilität nach 10 Minuten Inkubation zu beurteilen. n = 2-3 einzelne Spender (B) Färbung für CAR-Expression mit einem Anti-DYKDDDDK-Antikörper (konjugiert mit APC, 1:50 Endverdünnung). Nach dem Gateing auf lebensfähigen Zellen wurde entweder der Prozentsatz der CAR-positiven Zellen im Verhältnis zu MOCK-transfektierten Kontrollen (linkes Panel) oder die geometrische mediane Fluoreszenzintensität (GeoMean, rechtes Panel) der gesamten Population analysiert. Dargestellt werden Durchschnitte von n = 3 einzelnen Spendern ± S.D. (C) Repräsentative Punktdiagramme eines Spenders aus (B), die die Kinetik der CAR-Expression über die Zeit zeigen. (D) Analyse von CD4+/CD8+ T-Zellen und Vergleich von MOCK-transfektierten mit CAR-transfektierten T-Zellen und zwei verschiedenen Aktivierungsstrategien 24 Stunden nach der Elektroporation. Dargestellt sind Durchschnittswerte von n = 3 einzelnen Spendern ± S.D. (E) Phänotypische Analyse von MOCK-transfektierten und CAR-transfektierten T-Zellen, gezeigt in (B) 24 Stunden nach der Elektroporation. Dargestellt ist ein repräsentativer Spender von n = 3. (F) Analyse der muGFP-Expression 24 Stunden nach Elektroporation mit unterschiedlichen Mengen mRNA. Gating für lebende Zellen wurde durchgeführt, bevor der GeoMean für GFP quantifiziert wurde. Dargestellt sind Durchschnitte von n = 3 Spendern ± S.D. Abkürzungen; CAR = chimerischer Antigenrezeptor; mRNA = Boboten-Ribonukleinsäure; 7-AAD = 7-Aminoactinomycin; RT = Raumtemperatur; muGFP = mutiertes grünes fluoreszierendes Protein; S.D. = Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70162/70162fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

To assess the efficacy and potency of chimeric antigen receptor (CAR) T cells, it is essential to isolate, activate, expand, characterize, and genetically ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Herstellung von chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen ex vivo. Menschliche T-Zellen werden mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind, zusammen mit einem mit Interleukin-2 (IL-2) angereicherten Medium, was zu einer Aktivierung und Proliferation von T-Zellen führt. Transgene lentivirale Vektoren werden eingeführt, die es der transgenen RNA ermöglichen, sich in das Wirtsgenom zu integrieren und...

Eine ex vivo-Technik zur Herstellung chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Aktivierte murine CD8+ T-Zellen werden in eine Mikrotiterplatte gegeben, die mit rekombinanten Fibronektinfragmenten beschichtet ist. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA enthalten, die für einen antigenspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) kodieren, werden dann eingeführt, und die Platte wird zentrifugiert, um die Transduktion zu erleichtern.

Eine Technik zur Erzeugung antigenspezifischer CAR-T-Zellen

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

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Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen (Video) | JoVE Journal

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

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