Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Meine Forschung konzentriert sich darauf, einen standardisierten Cryo-ET-Workflow zu etablieren, um eine in-situ strukturelle Analyse dicker Gewebe wie des Maus-Hippocampus zu ermöglichen. Bestehende Methoden sind für dickes Gewebe nicht zuverlässig, daher integriert dieses Protokoll optimierte Schritte für standardisierte Analysen. Zunächst lege einen 10-Liter-Töpfchen mit 10%iger Saccharoselösung auf eine saubere Glasoberfläche.

Sezieren Sie schnell den Hippocampus einer frisch eingeschläfelten Maus. Entfernen Sie mit einer scharfen Rasierklinge kleine Gewebestücke von 0,5 bis 1 Kubikmillimeter. Mit einem Zahnstocher oder einer feinen Bürste wird das Gewebe auf die vorbereiteten Kupferstütz-TEM-Gitter im Hochdruckgefrierträger übertragen.

Verwenden Sie 2-Methylpentan, um das Gewebe feucht zu halten und seine Position auf dem Gitter anzupassen, während mechanische Belastungen minimiert werden, um Schäden am Gitter zu vermeiden. Anschließend decken Sie das Gewebe und das Gitter mit einer Kupferfolie mit 3 Millimeter Durchmesser ab. Um die Montage abzuschließen, legt man den zweiten Hochdruck-Gefrierträger, flach nach unten, obenauf zu einem versiegelten Waffelsandwich.

Und überprüfen Sie die Gefrierwerte, um sicherzustellen, dass keine Anomalie im Instrument vorliegt. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzeit von der Gewebedissektion bis zum Einfrieren 90 Sekunden nicht überschreitet. Besorgen Sie ein neues 300-Mesh goldenes Gitter, das als endgültiges Empfängergitter für das Lift-out-Verfahren dient.

Unter einem Stereomikroskop bei Raumtemperatur wird das Gitter vorsichtig in einen kompatiblen Cryo-FIB-AutoGrid-Ring eingeschnitten. Anschließend wird das zusammengebaute AutoGrid direkt in einem Trockenofen gelagert, der bei etwa 40 Grad Celsius gehalten wird, um die Frostansammlung vor der Nutzung zu minimieren. Während Sie die Baugruppe kontinuierlich in flüssigen Stickstoff eintauchen, trennen Sie das vitrifizierte TEM-Gitter sorgfältig von den umgebenden Waffelkomponenten.

Mit vorgekühlten, feinspitzen Pinzetten lösen Sie die beiden Hochdruck-Gefrierbehälter vorsichtig auseinander. Anschließend montiert man an einer vorgekühlten Kryo-Ladestation das isolierte Gewebegitter in einen zweiten Cryo-FIB AutoGrid-Ring unter dem Schutz von flüssigem Stickstoff. Laden Sie beide AutoGrids in die vorgesehenen Slots des Probenhalters des Kryotransfer-Shuttles.

Richten Sie jedes AutoGrid so aus, dass die Fräskerbe nach außen zeigt und vertikal positioniert ist, um einen geringeren Fräswinkel zu ermöglichen. Halten Sie das voll beladene Shuttle in flüssigen Stickstoff oder in vorgekühltem Zustand aufrechterhalten, bis es in das FIB-SEM übertragen wird. Laden Sie die Sample-Stufe mit dem Sample Rod in das Instrument.

Nach dem Kryotransfer ins Mikroskop navigieren Sie zum Gewebegitter mit niedriger SEM-Vergrößerung. Anschließend wird die Gitteroberfläche 15 Sekunden lang mit Platin bei 30 Milliampere beschichtet, um leitfähigen Schutz zu gewährleisten. Geben Sie eine 0,5 bis 1,0 Mikrometer dicke organometallische Platinkappe mit dem Gasinjektionssystem für etwa 60 Sekunden auf.

Trage eine abschließende, sputterbeschichtete Platinschicht mit 30 Milliampere für 15 Sekunden auf die Gitteroberfläche auf. Mit dem SEM-Elektronenstrahlbild navigieren Sie zum ausgewählten Bereich von Interesse im Gewebegitter. Um die Probe für das Fräsen an der Frontseite auszurichten, stellen Sie die Stufe auf etwa 110 Grad Drehung und 7 Grad Neigung ein, sodass die Probeoberfläche in einem für den Zugang zum Ionenstrahl geeigneten Winkel präsentiert wird.

Für das Grabenfräsen definieren Sie einen rechteckigen Graben, der den Zielgewebeblock umgibt, wobei der Ionenstrahl mit 30 Kilovolt betrieben wird. Beginnen Sie mit dem Fräsen in Abstand vom Block mit einem relativ hohen Strom von 15 Nanoampere, um eine schnelle Materialentfernung zu erreichen. Wenn sich die Grabenwände dem Block auf wenige Mikrometer nähern, reduzieren Sie den Ionenstrahlstrom auf 7 Nanoampere, um eine präzisere Fräsregelung zu erreichen.

Lassen Sie eine Seite des Blocks am Bulk Material befestigt, um eine temporäre Haltelasche zu schaffen. Für Gewebeblöcke mit einer geschätzten Dicke von mehr als 20 Mikrometern führen Sie einen Unterschnittsfrässchritt von der Rückseite aus, um den endgültigen Heben zu erleichtern. Drehen Sie die Bühne und passen Sie die Neigung an, um an den unteren Rand des Blocks zu gelangen.

Fräsen Sie die untere Verbindung mit dem fokussierten Ionenstrahl bei 30 Kilovolt und einem Strom von 3 Nanoampere. Fräsen Sie den Boden des Metallblocks so fest an den Probenblock an. Präzisionsfräsen Sie die Kontaktfläche zwischen Probe und Goldblock, um den Kontakt enger zu machen.

Um die Probe an der Nadel zu befestigen, stellen Sie sicher, dass der Goldblock direkten Kontakt mit der Zielprobe hat. Mit dem fokussierten Ionenstrahl bei 30 Kilovolt und 0,5 Nanoampere führen Sie 8 bis 12 aufeinanderfolgende Querschnittsfräsmuster an der Grenzfläche durch, um den Goldblock an die Probe zu schweißen. Um den Gewebeblock herauszuheben, trennen Sie die verbleibende Lasche, die den Block mit der Bulkprobe verbindet, mit dem fokussierten Ionenstrahl.

Manövriere vorsichtig die Mikromanipulatornadel, um den isolierten Gewebeblock vollständig aus dem Graben und dem umliegenden Gitter zu heben. Ziehe die Nadel ein und transportiere den Block zum Empfängergitter. Navigieren Sie mit der Mikromanipulatornadel zu einem vorgekühlten 300-Mesh goldenen Empfängergitter.

Senken Sie den Block auf ein ausgewähltes Gitterfeld. Schleife kleine Eiskristalle auf dem Gitter, damit der Gewebeblock und das Gitter fester haften. Senken Sie den Gewebeblock so, dass er nur mit dem Gitter in Kontakt kommt.

Mahlen Sie eine 3 bis 4 Mikrometer dicke Scheibe vom Block mit dem Ionenstrahl auf die Gitterfolie. Als Nächstes schweißen Sie die Scheibe sicher durch Fräsen, wobei Reinigungsquerschnittmuster auf beiden Seiten der Verbindungsstelle verwendet werden, und die leitfähige und schützende Beschichtung, wie zuvor gezeigt, wieder auf die Gitteroberfläche aufgetragen. Beim Lamellenverdünnen wird nach dem Setzen der Stufenkippe die endgültige Lamellenposition innerhalb eines glatten Bereichs des Gewebeblocks definiert.

Führen Sie systematische Fräsarbeiten unter Verwendung von Ionenstrahlströmen und Überneigungskompensationen durch, wie sie in der dargestellten Tabelle angegeben sind. Befindet man sich innerhalb von 1 bis 2 Mikrometern der Lamelle, kann optional ein Spannungsentlastungsgraben etwa 1,5 Mikrometer entfernt gefräst werden, um das Biegen oder Einrollen der Lamelle zu verhindern. Nach der Lamellenpräparation werden Bilder mit Kryo-Elektronenmikroskopie aufgenommen.

Gewebeblöcke, die durch Hochdruckgefrieren mit der Waffelmethode verarbeitet wurden, zeigten ein einheitliches und elektronendurchsichtiges Erscheinungsbild. Rekonstruierte Tomogramme haben mitochondriale Strukturen innerhalb der zellulären Umgebung aufgelöst. Makromolekulare Komplexe wie Ribosomen wurden im Zytoplasma eindeutig aufgelöst.

Zytoskelettale und membranassoziierte zelluläre Merkmale sowie nukleare Porenkomplexe waren ebenfalls in den rekonstruierten Tomogrammen sichtbar. Synaptische Strukturen und Merkmale, darunter Kalziumspeicher und Myelinhüllenstrukturen, waren in den Tomogramen deutlich zu sehen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die native zelluläre Außenstruktur direkt innerhalb komplexer Gewebeumgebungen zu untersuchen.

Die wichtigste Herausforderung bei diesem Kryo-ET-Protokoll ist die Erreichung einer einheitlichen, artefakfreien Vitrifizierung dicker Gewebeproben. Nach diesem Verfahren können Forscher Interessengebiete mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie oder Markierung lokalisieren und anschließend Subtomogramm-Mittelung und Strukturanalysen durchführen, um makromolekulare Komplexe aufzulösen.