Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Wir untersuchen die Replikation, Aufrechterhaltung und Verbreitung selbstreplizierter zirkulärer DNA-Elemente, bekannt als Plasmide, was die Bestimmung ihrer Sequenzen erfordert. Dieses Protokoll befasst sich mit Abdeckungs- und Genauigkeitsproblemen im Zusammenhang mit der Sequenzierung langer Lesevorgänge durch die Anreicherung von Plasmid-DNA und die Optimierung von Montagemethoden. Unser Protokoll ist darauf ausgelegt, Plasmide in Situationen zu sequenzieren, in denen die chromosomale Sequenz entweder bekannt oder irrelevant ist.

Um zu beginnen, streichen Sie die Proben auf LB-Auger-Platten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt sind, um den jeweiligen Plasmid-gebundenen Resistenzmarker auszuwählen. Inkubier die Platten bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Am nächsten Tag inokuliere drei bis fünf Milliliter LB-Medium, das mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt ist, mit einer einzelnen isolierten Kolonie.

Inkubier die Kultur mit Schütteln bei 37 Grad Celsius für etwa acht Stunden oder bis die optische Dichte bei 600 Nanometern eins bis zwei erreicht. Dann inokuliere 400 Milliliter LB-Medium, das mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt ist, mit 400 Mikrolitern der Starterkultur und inkubier wie zuvor gezeigt. Übertrage dann die Kultur in Zentrifugenflaschen, die für das Kulturvolumen geeignet sind.

Zentrifuge bei 4.200 G für 10 Minuten und resuspendiere den Niederschlag mit den vom Hersteller empfohlenen Reagenzvolumen. Nach Zelllyse und Neutralisation zentrifugie das Lysat bei 4.200 G für 30 Minuten. Übertrage den Überstand in ein neues Röhrchen und zentrifugiere es erneut.

Führe die Äquilibrierung, das Waschen und die DNA-Elution gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Resuspendiere dann die ausgefällte DNA in 100 Mikrolitern nuclease-freiem Wasser, um die Konzentration für die Nanopore-Bibliotheksvorbereitung zu maximieren. Bereiten Sie dann die Assay-Röhrchen gemäß der dargestellten Tabelle vor, um die DNA zu quantifizieren.

Nachdem Sie das Fluorometer kalibriert haben, setzen Sie die Probenröhren in das Fluorometer ein und notieren Sie die Messwerte gemäß dem Gerätehandbuch. Programmieren Sie den Thermocycler auf 30 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 80 Grad Celsius für zwei Minuten. Zentrifugier und mische die aufgetauten Kit-Komponenten gemäß der dargestellten Tabelle.

Inkubier die für das Barcoding vorbereiteten PCR-Röhrchen mit dem Thermocycler-Programm. Lege dann die Röhrchen auf Eis, um sie abzukühlen. Poole die barcoded Proben in einem sauberen 1,5 Milliliter Eppendorf-Röhrchen und stelle sicher, dass das Gesamtvolumen 1.000 Mikroliter nicht überschreitet.

Sobald die Perlen gevortext sind, füge ein gleiches Volumen an Perlen zu den gepoolten barcoded Proben hinzu. Mische durch Schütteln des Röhrchens und inkubier dann 10 Minuten lang. Wasche dann die Perlen mit einem Milliliter 80% Ethanol, während sie sich auf dem Magneten befinden.

Entferne das Ethanol und wiederhole den Vorgang. Entferne das Röhrchen vom Magneten. Resuspendiere die Perlen in Elutionspuffer unter Verwendung des angemessenen Volumens basierend auf der Anzahl der verwendeten Barcodes und inkubier für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Quantifiziere die DNA-Konzentration mit einem Mikroliter des eludierten Probens am Fluorometer, um die erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung zu bestätigen. Für die Adapterligation übertrage 11 Mikroliter der DNA-Bibliothek in ein neues Röhrchen und beschrifte es. Mische dann die dargestellten Komponenten in einem frischen Röhrchen, um den aufgetauten schnellen Adapter zu verdünnen.

Füge dann ein Mikroliter des verdünnten schnellen Adapters zu den 11 Mikrolitern der DNA-Bibliothek hinzu und schüttle das Röhrchen, um den Inhalt zu mischen. Zentrifugier das Röhrchen kurz, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Volumen am Boden sammelt, und inkubier das Röhrchen fünf Minuten lang auf der Arbeitsplatte. Bereite die Flow-Cell-Priming-Mischung in einem frischen DNA-Röhrchen vor und mische durch Invertierung und Pipettieren.

Hebe den Deckel des Geräts an und setze die Flow-Cell ein, während du sanften Druck ausübst, um die korrekte Platzierung sicherzustellen. Überprüfe, ob sich Luftblasen in oder neben dem Priming-Port befinden, und ziehe 20 bis 30 Mikroliter Flüssigkeit zurück, um Blasen zu entfernen. Ziehe dann 800 Mikroliter Priming-Mischung auf und gieße sie in den Priming-Port, wobei du Luftblasen vermeidest, und lass das Gerät fünf Minuten lang stehen.

Mische die DNA-Bibliothek mit dem angemessenen Volumen an Bibliotheksperlen in einem neuen Röhrchen, wie hier dargestellt. Lade 200 Mikroliter Priming-Mischung in den Flow-Cell-Priming-Port. Passe den Sample-Port-Abdeckung an, um den Port zu enthüllen.

Gib 75 Mikroliter der DNA-Bibliothek mit Perlen tropfenweise in den Sample-Port, wobei du jeden Tropfen absorbieren lässt, bevor du den nächsten hinzufügst. Befestige dann die Sample-Port-Abdeckung erneut und schließe den Priming-Port. Sobald der Deckel des Geräts geschlossen ist, beginne mit dem Sequenzierungsvorgang.

Legen Sie die Laufzeitbegrenzung basierend auf der Anzahl der Plasmide fest, die mit einem Standardwert von 48 Stunden und einem Maximum von 72 Stunden multiplexiert werden. Wählen Sie den supergenauen Base-Calling-Modus und die entsprechende schnelle Barcode-Kit-Option. Wählen Sie dann die rohen FAST5- oder POD5-Daten aus und beginnen Sie mit dem Base-Calling.

Um eine gefilterte FASTQ-Datei für die nachgeschaltete Montage zu erzeugen, trimmen Sie lange Lesevorgänge mit Filtlong, um ungefähr 5-10%der Lesevorgänge mit der niedrigsten Qualität zu entfernen, während ungefähr 90%der Gesamtausbeute erhalten bleiben. Subsample die Lesevorgänge gemäß den empfohlenen Einstellungen mit Autocycler. Montieren Sie jeden Lesevorgangsuntersatz mit Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler und anderen ausgewählten Montageprogrammen.

Visualisiere jede Montage-Grafikdatei mit Bandage. Bewerte die Contigs auf Zirkularität, Größenkonsistenz über Montageprogramme hinweg und Beweise für chimäre Verbindungen. Entferne lineare Contigs, die keine Unterstützung über mehrere Montageprogramme hinweg haben, und behalte kreisförmige Contigs mit konsistenten Größenschätzungen bei.

Entferne geringfügige nicht unterstützte Contigs vor der Konsensgenerierung, wenn die Hauptplasmide zirkularisiert werden. Fahren Sie mit der Konsensgenerierung nach manueller Kuration fort. Erzeugen Sie die Konsensussequenz mit Autocycler mit den kuratierten Montageprogrammen.

Führe die verbleibenden Autocycler-Befehle aus, um die endgültige Konsensus-Plasmidsequenz zu erzeugen. Polieren Sie schließlich die endgültige Montage mit gekürzten langen Lesevorgängen mit Medaka, um die Konsensusgenauigkeit zu verbessern. Alle Konjugationsassays produzierten Transkonjuganten, was die Anwesenheit eines konjugativen Plasmids in den Spendern bestätigte.

Die Größen der assemblierten Plasmidsequenzen stimmten mit Schätzungen überein, die auf der Mobilität der Pulsfeld-Gelelektrophorese basierten. Die Nanopore-Sequenzierung produzierte ausreichende Lesevorgänge und Qualität für alle analysierten Proben. Die Chromosomenkontaminationsraten lagen zwischen 72,1% und 28,0% mit einem Durchschnitt von 46,9%. Die Pulsfeld-Gelelektrophorese-Analyse des Plasmids der UPEC_271-Stämme ergab eine Bande, die einem Plasmid von ungefähr 145 Kilobasenpaaren entspricht.

DNA aus einem der Transkonjuganten zeigte eine Sequenz, die mit den 145 Kilobasen identisch war. Die Pulsfeld-Gelelektrophorese-