Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Wir untersuchen die Replikation, Erhaltung und Verbreitung selbstreplizierender zirkulärer DNA-Elemente, bekannt als Plasmide, die die Bestimmung ihrer Sequenzen erfordern. Dieses Protokoll adressiert Abdeckungs- und Genauigkeitsprobleme im Zusammenhang mit Long-Read-Sequenzierung, indem es Plasmid-DNA anreichert und Assemblierungsmethoden optimiert. Unser Protokoll ist darauf ausgelegt, Plasmide in Situationen zu sequenzieren, in denen die chromosomale Sequenz entweder bekannt oder irrelevant ist.

Zu Beginn strichen Sie die Proben auf LB-Schneckenplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, um den jeweiligen plasmidübertragenen Resistenzmarker auszuwählen. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag inokulieren Sie drei bis fünf Milliliter LB Medium, ergänzt mit dem passenden Antibiotikum und einer einzigen isolierten Kolonie.

Inkubieren Sie die Kultur mit einem Schütteln bei 37 Grad Celsius für etwa acht Stunden oder bis die optische Dichte bei 600 Nanometern eins bis zwei erreicht. Anschließend inokulieren Sie 400 Milliliter LB-Medium, ergänzt mit dem passenden Antibiotikum und 400 Mikrolitern der Starterkultur, und inkubieren Sie wie zuvor gezeigt. Dann wird die Kultur in Zentrifugenflaschen übertragen, die dem Kulturvolumen entsprechen.

Zentrifugiere bei 4.200 G für 10 Minuten und suspendiere das Pellet mit den vom Hersteller empfohlenen Reagenzvolumen. Nach der Zelllyse und Neutralisation wird das Lysat bei 4.200 g für 30 Minuten zentrifugiert. Übertragen Sie das Supernatant in ein neues Rohr und zentrifugieren Sie es erneut.

Führen Sie Gleichgewichtung, Waschen und DNA-Elution gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Anschließend wird die ausgefällte DNA in 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser wieder suspendiert, um die Konzentration für die Nanoporenbibliothek zu maximieren. Um die DNA zu quantifizieren, bereiten Sie anschließend die Prüfröhren gemäß der dargestellten Tabelle vor.

Nach der Kalibrierung des Fluorometers werden die Probenröhrchen in das Fluorometer eingefügt und die Messwerte gemäß dem Instrumentenhandbuch erfasst. Programmieren Sie den Thermozyklus für zwei Minuten auf 30 Grad Celsius, gefolgt von 80 Grad Celsius für zwei Minuten. Drehen und mischen Sie die aufgetauten Bausätze gemäß der angegebenen Tabelle.

Inkubieren Sie die für die Barcode vorbereiteten PCR-Röhren mit dem Thermal Cycler-Programm. Dann lege ich die Schläuche auf Eis, damit sie abkühlen. Sammeln Sie die barcodeartigen Proben in einem sauberen 1,5-Milliliter-Eppendorf-Rohr, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen 1.000 Mikroliter nicht überschreitet.

Sobald die Perlen vortexiert sind, fügen Sie ein gleiches Volumen an Perlen zu den gesammelten barcodeartigen Proben hinzu. Mischen Sie durch Flicken des Rohrs, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation. Waschen Sie die Perlen dann mit einem Milliliter 80%-Ethanol, während Sie am Magneten sind.

Entferne das Ethanol und wiederhole das einmal. Nimm das Rohr vom Magneten ab. Die Perlen im Elutionspuffer mit dem passenden Volumen basierend auf der Anzahl der verwendeten Barcodes wieder suspendieren und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.

Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem Mikroliter der entweichten Probe auf dem Fluorometer, um die erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung zu bestätigen. Für die Adapterligierung werden 11 Mikroliter der DNA-Bibliothek in ein neues Röhrchen übertragen und beschriftet. Dann mischen Sie die präsentierten Komponenten in ein frisches Rohr, um den aufgetauten Schnelladapter zu verdünnen.

Gib als Nächstes einen Mikroliter verdünnten Schnelladapters der 11 Mikroliter DNA-Bibliothek hinzu und schnippe das Rohr, um den Inhalt zu mischen. Drehen Sie das Rohr kurz herunter, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Volumen am Boden sammelt, und inkubieren Sie das Rohr fünf Minuten lang auf der Werkbank. Bereiten Sie die Flow Cell Priming-Mischung in einem frischen DNA-Röhrchen vor und mischen Sie sie durch Inversion und Pipetten.

Heben Sie den Deckel des Geräts an und setzen Sie die Durchflusszelle hinein, während Sie sanften Druck ausüben, um eine korrekte Platzierung sicherzustellen. Nachdem Sie auf Luftblasen innerhalb oder neben dem Zündkanal geprüft haben, entnehmen Sie 20 bis 30 Mikroliter Flüssigkeit, um die Blasen zu entfernen. Dann nehmen Sie 800 Mikroliter Priming-Mix auf, geben Sie es in den Priming-Port, wobei Luftblasen vermieden werden, und lassen Sie das Gerät fünf Minuten einwirken.

Mische die DNA-Bibliothek mit dem entsprechenden Volumen der Bibliotheksperlen in einer neuen Tube, wie hier dargestellt. Laden Sie 200 Mikroliter Priming-Gemisch in den Durchflusszellen-Priming-Port. Stellen Sie die Abdeckung des Sample-Ports so ein, dass der Port sichtbar wird.

Gib 75 Mikroliter der DNA-Bibliothek mit Perlen tropfen für Tropfen in den Probenport, sodass jeder Tropfen absorbiert werden kann, bevor der nächste hinzugefügt wird. Dann legen Sie die Abdeckung des Probeports wieder an und schließen Sie den Priming-Port. Sobald der Gerätedeckel geschlossen ist, beginnen Sie mit der Sequenzierung.

Setze das Laufzeitlimit basierend auf der Anzahl der multiplexierten Plasmide mit einer Standardlaufzeit von 48 Stunden und maximal 72 Stunden. Wählen Sie den supergenauen Basisanrufmodus und die passende Schnell-Barcode-Kit-Option. Dann wähle die rohen FAST5- oder POD5-Daten aus und beginne mit dem Basisaufruf.

Um eine gefilterte FASTQ-Datei für die nachgelagerte Montage zu erzeugen, schneiden Sie lange Lesungen mit Filtlong, um etwa 5–10 % der qualitativ schlechtesten Lesearten zu entfernen, während etwa 90 % der Gesamtausbeute erhalten bleiben. Subsample-Lesungen werden mit Autocycler gemäß den empfohlenen Einstellungen durchgeführt. Jede Lese-Teilmenge wird mit Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler und anderen ausgewählten Assemblern zusammengesetzt.

Visualisieren Sie jede Assembler-Graphdatei mit Bandage. Bewerten Sie Contigs hinsichtlich Zirkularität, Größekonsistenz über Assembler hinweg und Hinweise auf chimerische Gelenke. Entfernen Sie lineare Contigs, die über mehrere Assembler hinweg keine Unterstützung haben, und behalten Sie kreisförmige Contigs mit konsistenten Größenschätzungen bei.

Entfernen Sie kleinere nicht unterstützte Kontigs vor der Konsensbildung, wenn große Plasmide zirkularisiert werden. Fahren Sie nach manueller Kuratierung zur Konsensgenerierung über. Generiere die Konsenssequenz mit Autocycler und den kuratierten Assemblies.

Führe die verbleibenden Autocycler-Befehle aus, um die finale Konsens-Plasmidsequenz zu erzeugen. Zuletzt poliert man die Endmontage mit getrimmten Longreads mit Medaka, um die Konsensgenauigkeit zu verbessern. Alle Konjugationsassays erzeugten Transkonjuganten, was das Vorhandensein eines konjugativen Plasmids in den Spendern bestätigte.

Die Größen der zusammengesetzten Plasmidsequenzen stimmten mit Schätzungen überein, die auf der Mobilität der Pulsfeldgel-Elektrophorese basieren. Die Nanoporensequenzierung lieferte ausreichende Leseausgabe und Qualität für alle analysierten Proben. Die chromosomalen Kontaminationsraten lagen zwischen 72,1 % und 28,0 % mit einem Durchschnitt von 46,9 %. Die Analyse der Pulsfeld-Gel-Elektrophorese des Stammplasmids UPEC_271 zeigte ein Band, das einem Plasmid von etwa 145 Kilobasenpaaren entspricht.

DNA von einem der Transkonjuganten zeigte eine Sequenz, die identisch mit den 145 Kilobasen war. Die Pulsfeld-Gelelektrophorese-Analyse des Stammblutes 100913 identifizierte zwei Plasmide mit etwa 70 und 110 Kilobasenpaaren. Die Nanoporensequenzierung bestätigte zwei Plasmidassemblierungen mit 71.182 Basenpaaren und 111.226 Basenpaaren.

Die wichtigste Überlegung ist, ob die chromosomale Sequenz von Interesse ist. Falls ja, sind Standard-Ganzgenomsequenzierungsprotokolle besser. Die erhöhte Abdeckung unseres Protokolls öffnet die Tür zur Untersuchung der Heteroplasmie, d. h.

Plasmidsequenzvariation innerhalb einer gegebenen Population.