Name: Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Lernen Sie eine Nanopore-Sequenzierungsmethode zur Maximierung von Plasmid-DNA-Erträgen und Sequenzierungsgenauigkeit. Dieses Protokoll ermöglicht effizientes paralleles Sequenzieren mehrerer Proben mit Escherichia coli.

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```html
<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>1.5 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>15 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>250 mL sterile flasks&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424R-PR-R</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R-P-R</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Disposable Inoculating Loops: 1 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Electronic Digital Scale</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-355-720</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Ethanol-resistant markers</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Flow cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Jede Marke von Nitrilhandschuhen funktioniert</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP26184</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>MinION Sequencing Device&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI Plasmid DNA Extraction Kit</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube racks</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp;R96PCRFSP</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>PCR tubes: (0.2 mL)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Program autocycler v0.5.2</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bcftools v1.22</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools team)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bwa v0.7.19</td><td>Heng Li, ursprünglich am Broad Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program canu v2.3</td><td>University of California, Davis &amp; Pacific Biosciences collaborators</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program flye v2.9.6</td><td>University of California, San Diego (Pavel Pevzner lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program medaka v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program metamdbg&nbsp;v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program miniasm v0.3</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minipolish&nbsp; v0.2.0&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program racon v1.5.0</td><td>Genome Institute of Singapore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program samtools v1.22.1</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools project)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; Assay Tubes</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>Set of micropipettes that dispense between 1 &ndash; 10 &mu;L (P10), 2 &ndash; 20 &mu;L (P20), 20 &ndash; 200 &mu;L (P200) and 200 &ndash; 1000 &mu;L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Mikropipetten sollten kalibriert sein</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Sterilized tips for 10 &mu;L, 200 &mu;L and 1000 &mu;L&nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221052</td><td>Kann durch eine andere Marke ersetzt werden</td></tr></tbody></table>
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langlesen-plasmid-sequenzierung und -montage mit workflows auf basis von nanoporensequenzierungen

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

The present study describes a workflow for nanopore sequencing designed to maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy. Researchers cover each step ...

long-read-plasmid-sequencing-assembly-using-nanopore-sequencing-based

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Nanopore Technologie für Sequenzierung Biomoleküle hat breite Anwendungen in den Lebenswissenschaften einschließlich der Identifizierung von Krankheitserregern, Lebensmittelüberwachung Sicherheit, Genomanalyse, metagenomic Umweltüberwachung und Charakterisierung von bakteriellen Antibiotika-Resistenz. In diesem Artikel wird das Verfahren für die metagenomische Boden DNA-Sequenzierung zur Speziesidentifizierung mit Nanopore Sequenzierung Technik demonstriert.

Nanopore DNA-Sequenzierung für metagenomische Bodenanalyse

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Die Nanopore-Sequenzierung ist eine neuartige Technologie, die eine kostengünstige Sequenzierung an entfernten Orten und ressourcenarmen Umgebungen ermöglicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Sequenzierung von mRNAs aus Vollblut vor, das mit solchen Bedingungen kompatibel ist.

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Zuvor haben wir ein Protokoll für die Sequenzierung des Amplikon-basierten Ganzgenoms Usutu Virus (USUV) auf einer Nanoporensequenzierungsplattform validiert. Hier beschreiben wir die verwendeten Methoden genauer und bestimmen die Fehlerrate der Nanoporen-R10-Durchflusszelle.

Validierung der Nanoporensequenzierung des gesamten Genoms anhand des Usutu-Virus als Beispiel

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.

Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf von Ex-vivo - oder In-vitro-Zellkulturen bis hin zur transkriptomischen Datenvorverarbeitung für ein kostengünstiges Transkriptom-basiertes Wirkstoff-Screening.

Kosteneffizientes transkriptomisches Wirkstoff-Screening

Die In-vivo-Assemblierung ist eine ligationsunabhängige Klonierungsmethode, die auf intrinsischen DNA-Reparaturenzymen in Bakterien beruht, um DNA-Fragmente durch homologe Rekombination zusammenzusetzen. Dieses Protokoll ist sowohl zeit- als auch kosteneffizient, da nur wenige Reagenzien benötigt werden und die Klonierungseffizienz bis zu 99 % betragen kann.

Verwendung von In-vivo-Assemblierung für den hocheffizienten Plasmidbau

Dieses Protokoll wurde für die gezielte Tiefensequenzierung von 18 Arzneimittelresistenzregionen bei Mycobacterium tuberculosis unter Verwendung einer Long-Read-Sequenzierungsplattform optimiert, gefolgt von der Analyse mit einer Tuberkulose-spezifischen Bioinformatik-Pipeline, die für Long-Read-Daten ausgelegt ist.

Amplikon-Sequenzierung mit den Long-Read-Sequenzierungstechnologien

Einzelne Zell Sequenzierung ist ein immer beliebter und zugängliches Werkzeug für genomische Veränderungen bei hoher Auflösung Adressierung. Wir bieten ein Protokoll, das einzelne Zelle Sequenzierung verwendet Kopienzahl Veränderungen in einzelnen Zellen zu identifizieren.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Lernen Sie eine Nanopore-Sequenzierungsmethode zur Maximierung von Plasmid-DNA-Erträgen und Sequenzierungsgenauigkeit. Dieses Protokoll ermöglicht effizientes paralleles Sequenzieren mehrerer Proben mit Escherichia coli.

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

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