Standortspezifische Lysinlaktylierung durch genetische Code-Erweiterung in E. coli und Säugetierzellen

Wir entwickelten ein Uhr-/RS-tRNA-System, um Mimikry und Enzymbeschränkungen zu überwinden und so eine präzise Einbindung von Lysinlaktylation zur Untersuchung ihrer biologischen Substanz zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann zur Untersuchung des Tumorstoffwechsels, der Enzymfunktionen und der Uhrstellen angewendet werden. Zu Beginn ko-transformieren Sie 50 Mikroliter chemisch kompetente Zellen von Escherichia coli DH10B mit jeweils etwa 100 Nanogramm der gewünschten Plasmide. Inkubieren Sie die Transformationsmischung 25 Minuten auf Eis und geben Sie sie dann 45 Sekunden lang mit 42 Grad Celsius Hitzeschock.

Kühlen Sie das Rohr für drei Minuten wieder auf Eis. Fügen Sie 350 Mikroliter Luria-bertani-Medium hinzu und schütteln Sie die Tube kräftig mit 220 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nun verteilt die transformierte Zellkultur auf eine Luria-bertani-Agarplatte, die mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt wird.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 12 bis 16 Stunden. Dann nimmt man eine einzelne Kolonie von der Platte, um eine Vier-Milliliter-Starterkultur zu impfen, und brütet sie über Nacht aus. Am nächsten Tag wird die Übernachtkultur auf 400 Milliliter Luria bertani Medium mit Ampicillin und Chloramphenicol erweitert.

Schütteln Sie die Kultur kräftig mit 220 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,6 und 0,8 liegt. Anschließend wird die Kultur mit 0,2 % L-Arabinose und einem millimolaren Lactyllysin induziert und 16 Stunden lang bei 30 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Samenzellen auf einer 12-Well-Platte mit einer Dichte von eins mal 10 pro Brunnen mit der Stärke von fünf Zellen pro Bohrloch, wobei ein Milliliter DMEM verwendet wird.

Inkubieren Sie 24 Stunden, bis die Zellkonfluenz zwischen 70 und 80 % liegt, und dann mit der Transfektion übergehen. Zur Herstellung der verdünnten DNA-Lösung geben Sie 0,75 Mikrogramm Plasmid mit sfGFP-Reporter und pNeu-KlacRS im Eins-zu-Eins-Verhältnis in 38 Mikroliter serumfreies DMEM mit hohem Glukosespiegel. Sanft auf und ab pipetieren oder kurz vortexen, um zu mischen.

Um das verdünnte Transfektionsreagenz herzustellen, geben Sie 2,25 Mikroliter Transfektionsreagenz zu 38 Mikrolitern serumfreiem DMEM mit hohem Glukoseniveau. Vorsichtig drei- bis viermal hoch- und runterpipetten, um gründlich zu vermischen. Fügen Sie das verdünnte Transfektionsreagenz sofort der verdünnten DNA-Lösung zu.

Dann pipette drei- bis viermal hoch und runter, um den Inhalt zu mischen, und brüte die Lösung 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, damit sich Transfektion und DNA-Komplexe bilden können. Geben Sie in jedem Brunnen 50 Mikroliter der Transfektion und des DNA-Komplexes tropfweise auf das Medium und bewegen Sie die Platte vorsichtig, um die Mischung zu homogenisieren. Sechs Stunden nach der Transfektion wird das Medium durch frisches DMEM mit einem millimolaren Lactyllysin ersetzt und die Zellen für 24 bis 48 Stunden kultiviert.

Bei Escherichia coli wurde vollwertiges hENO1-89Klac gebildet, als ein millimolares Lactyllysin dem Wachstumsmedium zugesetzt wurde. Das Immunblotting bestätigte das Vorhandensein von Full-Length-HENO1-89Klac unter Verwendung von Anti-His Tag und Anti-L-L-L-Lactyl Lysin-Antikörpern. Die Electrospray-Ionisationszeit-Massenspektrometrie zeigte einen dominanten Peak bei 48.178 Dalton, was der erwarteten Masse von hENO1-89Klac ohne das einleitende Methionin entsprach.

Die Tandem-Massenspektrometrie des Triptychon-Verdauers bestätigte die ortsspezifische Einbindung von Klac am Rest 89 durch das Vorhandensein einer vollständigen B&Y-Ionenserien-Abbildung auf das modifizierte Peptid. Bei Säugetier-HEK293T-Zellen zeigte die Fluoreszenzmikroskopie eine starke sfGFP-Expression in den gesamten Zellen, wenn Klac für 24 und 48 Stunden hinzugefügt wurde, während ohne Klac-Supplementierung keine Fluoreszenz beobachtet wurde. Die Flowzytometrie zeigte, dass etwa 31 % der Zellen nach 24 Stunden sfGFP exprimierten, was nach 48 Stunden Klac-Supplementierung auf etwa 37 % anstieg.

Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der ortsspezifischen Lysinlaktylierungseffekte auf die Proteinfunktion und erleichtert die Messung der daraus resultierenden biologischen und funktionellen Ergebnisse. Nach diesem Verfahren können Forscher mechanistische Studien durchführen, Hochdurchsatz-Screening-Assays durchführen und stabile Zelllinien für erweiterte funktionelle Analysen erzeugen. Unsere zukünftigen Studien zielen darauf ab, die Effizienz zu verbessern, stabile Integration zu ermöglichen und die Takt-Biosynthese zu entwickeln.