Zervikales Lymphkanal-Rattenmodell zur Bestimmung des lymphatischen Transports vom Kopf und Gehirn

Unser Projekt untersucht, wie die Lymphatik des Gehirns mit ZNS-Erkrankungen wie Alzheimer, Schlaganfall und Neuroinflammation zusammenhängt, indem wir Substanzen identifizieren, die aus dem Gehirn abfließen. Bestehende Methoden fehlten ein Protokoll und ein zuverlässiger Ansatz, um theoretisch den von ZNS abgeleiteten lymphatischen Abfluss zu betasten und zu quantifizieren, was durch dieses Protokoll ermöglicht wird. Zu Beginn werden etwa 0,7 Milliliter verdünnte Antikoagulanslösung in eine ein-milliliter sterile Insulinspritze mit einer 30-Gauge-Nadel zur Beschichtung der Innenseite der Polyethylenkanüle vorgeladen.

Lagern Sie die vorgeladene Spritze unter sterilen Bedingungen bis zur Benutzung. Zur Herstellung von Kanülen verwenden Sie Rohre mit 0,5 mm Außendurchmesser und 0,3 mm Innendurchmesser für beide Endabschnitte sowie 0,6 Millimeter Außendurchmesser und 0,5 Millimeter Innendurchmesser für den Mittelteil. Mit einer Schere werden die Kanülensegmente für den proximalen Teil, der mit der Spritzennadel verbunden ist, 40 Zentimeter für den mittleren Abschnitt und acht Zentimeter für den distalen Teil, der für die Kannulation vorgesehen ist, zugeschnitten.

Bauen Sie die Kanüle in einer Kopf-zu-Schwanz-Konfiguration zusammen. Dann schneiden und schrägen Sie das distale Ende der Kanüle in einem Winkel von etwa 45 Grad ab, um ein sanftes Einsetzen in den Halswirbellymphkanal zu ermöglichen. Überprüfen Sie die Öffnung jeder Kanüle, indem Sie die vorgeladene Spritze an das proximale Ende der zusammengesetzten Kanüle anschließen.

Geben Sie vorsichtig ein kleines Volumen Lösung frei, um die Kanüle zu spülen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung reibungslos vom distalen Ende abtritt, ohne Anzeichen von Undichtigkeiten. Positioniere eine betäubte Ratte im Rücken auf eine beheizte OP-Platte, die bei 37 Grad Celsius gehalten wird.

Neigen Sie den Kopf und strecken Sie den Nacken mit einem kleinen Stützkissen, falls nötig, um die Nackenzone zu erhöhen. Sichern Sie die Vordergliedmaßen vorsichtig mit Gummibändern oder chirurgischen Klebebanden, um die Bewegung zu minimieren. Spülen Sie das Fell über dem Gebärmutterhalsbereich mit steriler Kochsalzlösung, um das Rasieren zu erleichtern.

Anschließend wird die gesamte Operationsstelle gründlich rasiert, um sicherzustellen, dass das Fell vor dem Schnitt vollständig entfernt ist. Markieren Sie die Operationsstelle, indem Sie eine 2,5 Zentimeter lange gestrichelte Linie zeichnen, um die Länge des ursprünglichen Schnitts zu bestätigen. Setzen Sie das obere Ende des Schnitts etwa ein bis 1,5 Zentimeter unterhalb der Unterlippe.

Nachdem die Anästhesietiefe durch den Zehenkniffreflex bestätigt wurde, schneiden Sie vorsichtig die oberflächliche Schicht der Halsmuskulatur entlang der markierten Linie ein. Anschließend werden die verbleibenden Muskelschichten, hauptsächlich die oberflächliche Halsfaszie, vorsichtig getrennt, um die Halsarterie freizulegen. Ziehen Sie den Musculus sternomastoideus und die submandibuläre Drüse zurück und neigen Sie sie vom Operationsfeld weg, um die Erkennung des Halslymphkanals zu erleichtern.

Verwenden Sie einen Gewebeexpander, um das Operationsfenster aufrechtzuerhalten. Mit einem Wattestäbchen halten Sie Muskelgewebe vorübergehend beiseite, während Sie den Lymphknoten und den zugehörigen Lymphkanal lokalisieren. Lokalisieren Sie den undurchsichtigen, farblosen, zervikalen Lymphkanal, der parallel zur Halsschlagader verläuft.

Mit einer stumpfen Zange führen Sie vorsichtig durch das getrennte Bindegewebe und halten Sie die Pinzette in Position. Isolieren Sie sorgfältig den zervikalen Lymphgang von den umliegenden Binde- und Fettgeweben durch eine stumpfe Dissektion. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt in der oberen Hälfte des freiliegenden Gefäßes.

Eine kleine sekundäre Hautpunktion etwa 1,5 Zentimeter vom Operationsfenster entfernt kann als zusätzlicher Fixierungspunkt für die Kanüle dienen. Führen Sie die Kanüle durch die zweite Öffnung ein, greifen Sie mit der Zange ihr distales Ende und stellen Sie sicher, dass die abgeschrägte Fläche nach oben gerichtet ist. Dann führt man das distale Ende vorsichtig etwa zwei Millimeter durch den Schnitt in den Lymphgang ein und richtet ihn zum Kopf aus.

Überwachen Sie das proximale Ende der Kanüle ein bis zwei Minuten. Bestätigen Sie die erfolgreiche Kanulierung, indem Sie einen langsamen und stetigen Ausfluss der Lymphflüssigkeit beobachten. Sichern Sie die Kanüle, indem Sie mit einer Pipette einen kleinen Tropfen Cyanoacrylat-Gewebeklebstoff an der Schnittstelle und am sekundären Fixierungsloch auftragen.

Beobachten Sie den Lymphfluss mehrere Minuten, um einen gleichmäßigen Abfluss zu bestätigen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Gewebeexpander und setzen die Untermandibulardrüse an ihren ursprünglichen Standort zurück. Befestigen Sie ein vorgelabeltes, mit Antikoagulanti beschichtetes Mikrozentrifugenrohr am distalen Ende der Kanüle.

Dann werden alle Muskelschichten an ihre ursprünglichen Positionen neu positioniert und der Hautschnitt mit Nähten und/oder Gewebeklebstoff verschlossen. Sammeln Sie kontinuierlich Lymphe in antikoagulantiumbeschichtete Mikrozentrifugenröhren und ersetzen Sie die Röhren in vorgegebenen Abständen, typischerweise stündlich. Stellen Sie sicher, dass die Ratte während der gesamten Sammelphase betäubt bleibt.

Bewahren Sie die gesammelten Proben zusammen mit Kühlpackungen in einer Kühlbox auf. Die stündlichen Lymphflussraten, gemessen über einen sechsstündigen Sammelzeitraum bei erfolgreich kanülierten Ratten, lagen zwischen 0,09 und 0,13 Millilitern pro Stunde. Bei gesunden Ratten blieb der kumulative lymphatische Transport von intrastriatal verabreichtem, tritium-markiertem Albumin in den ersten zwei Stunden vernachlässigbar und nahm danach deutlich zu.

Der Vergleich der tritiummarkierten Albuminkonzentrationen zwischen Lymphe und Plasma zeigte unterschiedliche Konzentrationsprofile im Laufe der Zeit bei gesunden Ratten. Die durch interperitoneale Verabreichung von Escherichia coli Lipopolysaccharid induzierte Neuroentzündung war mit einer leicht verringerten Gesamtlymphflussrate über acht Stunden und einer nahezu doppelten Verringerung des Anteils der Gesamtdosis, der in die Lymphe transportiert wurde, verbunden. Das Lymph-Plasma-Konzentrationsverhältnis zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen gesunden und neuroentzündeten Ratten, was auf ähnliche Kreuzungsprofile der zervikalen Lymphatik hinweist.

Dieses Protokoll ermöglichte eine direkte biologische Probenahme von gehirnabgeleiteter Lymphe, wobei eine Brücke zwischen indirekter externer Bildgebung oder harzhaltiger Methode und messbarem Ausfluss des zentralen Nervensystems wurde. Das Protokoll ermöglicht die zentral verabreichte Arzneimittelfreigabe über lymphatische Bahnen und ermöglicht so die Messung der Abflusswege und der Clearance-Raten. Zukünftige Studien können untersuchen, wie ZNS-Krankheitszustände auf die lymphatische Clearance aufmerksam machen, und dieses Wissen nutzen, um Medikamente zur Wiederherstellung der lymphatischen Gehirnfunktion für die Behandlung zu optimieren.