Kartierung der Infant-Immunität mit minimalem Input: Integratives Einzelzell- und multiomisches Profiling

Unsere Forschung definiert, wie sich die Immunität im frühen Leben nach der Geburt anpasst, indem wir longitudinales hochdimensionales multiomisches Profiling aus kleinen Blutvolumen verwenden. Dieses Protokoll kann auf neonatale und pädiatrische Studien zur longitudinalen Immunprofilierung aus begrenzten Bioproben über Gesundheit, Infektion und Entzündung angewendet werden. Zunächst tauen Sie schnell ein Fläschchen mit lysierten roten Säuglingsblutkörperchen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf.

Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr mit 10 Millilitern warmem, vollständigem RPMI-Medium bei 37 Grad Celsius. Zentrifugiere das Rohr bei 400 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entsorge das Überlagerungsmittel. Das Zellpellet in drei Millilitern vollständigen RPMI-Medium wieder suspendieren und die Gesamtzahl der Zellen zählen.

Verdünnen Sie die Probe, wenn die Konzentration zu hoch zum Zählen ist. Nach dem Zählen der Zellen wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und suspendieren Sie die Zellen erneut in einem vollständigen RPMI-Medium, um eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Bringen Sie 100 Mikroliter mit 0,1 Millionen Zellen in jede Öffnung einer 96-Well-V-Bodenplatte.

Zentrifugiere die Platte mit 764 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorge das Supernatant. Als Nächstes geben Sie 100 Mikroliter lebende tote Farbstoff, verdünnt von einem auf 2.000 in PBS mit FC-Block und Monocytenblock verdünnt von 100 bis 100 Proben außer der unverfärbten Kontrolle dazu.

Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zum Waschen der Zellen geben Sie 100 Mikroliter PBS dazu. Zentrifugiere die Platte bei 764 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge vorsichtig das Supernatantum.

Fügen Sie 100 Mikroliter Oberflächenantikörpercocktail, verdünnt von einem bis 200 in fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer, zu allen Proben außer der unverfärbten Kontrolle hinzu. Brüte 30 Minuten bei vier Grad Celsius aus. Anschließend werden die Zellen mit 100 Mikrolitern FACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und das Übersetzungsmittel entsorgt.

Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzufügen. 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann die Zellen erneut waschen und in 200 Mikrolitern FACS-Puffer erneut suspendieren. Bereiten Sie UltraComp-Kompensationsperlen als einfarbige Steuerungen vor.

Färben Sie die einfarbigen Kontrollperlen nach demselben Verfahren wie die Proben, einschließlich der Fixierung, wenn die Proben fixiert waren. Bereite außerdem Fluoreszenz minus eins oder FMO-Kontrollen auf dieselbe Weise vor. Führen Sie die Proben, einfarbige Kontrollen, unverfärbte Kontrollen und fluoreszierende Minus-eins-Kontrollen mit einem herkömmlichen oder spektralen Durchflusszytometer durch.

Öffnen Sie FlowJo und wählen Sie die zu analysierende Probe aus. Stellen Sie die Gatter mit geeigneten Isotyp- und FMO-Kontrollen ein. Gate-Leukozyten mit FSC versus SSC, um Ablagerungen auszuschließen, und Zellen nach Größe und Granularität auswählen.

Doublets mit FSCA statt FSCH ausschließen. Gate lebende Zellen mit einem Viabilitäts-Farbstoff, um tote Zellen auszuschließen. Aus lebenden Einzelzellen teilen sie sich in CD33-negative Lymphozyten und CD-33-positive myeloide Zellen.

In CD33-positiven Zellen werden CD14-positive Monozyten identifiziert. Anschließend identifizieren Sie in CD33-positiven Zellen CD14-negative, CD11C-positive dendritische Zellen. Jetzt gehen CD33-negative Lymphozyten CD3-positive T-Zellen und CD3-negative, CD56-positive natürliche Killerzellen.

Innerhalb von CD3-positiven T-Zellen identifizieren Sie CD8-positive und CD4-positive Untergruppen sowie CD3-negative, CD56-negative und CD19-positive B-Zellen. Zunächst tauen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten roten Blutkörperchen-lysierten Zellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-konisches Rohr mit 10 Millilitern T-Zell-Medien und zentrifugieren Sie bei 430 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorge das Supernatant. Nachdem das Zellpellet mit einem Milliliter PBS erneut suspendiert wurde, geben Sie der Probe weitere neun Milliliter PBS hinzu. Zentrifugiere das Rohr bei 430 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant.

Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit mit Trypan-Blau-Ausschluss. Wenn die Lebensfähigkeit unter 70 % liegt, verwenden Sie wie folgt ein Kit zur Entfernung toter Zellen. Zuerst bereiten Sie den 1x-bindenden Puffer vor, indem Sie die 20-fach-bindende Pufferlösung mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser verdünnen.

Setzen Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter Mikroperlen zur Entfernung toter Zellen pro 10 Mal in der Potenz von insgesamt sieben Zellen auf. Gut mischen und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Setzen Sie die magnetische Trennsäule zusammen mit einem Sammelrohr in den entsprechenden magnetischen Halter.

Anschließend wird die Säule durch Spülen mit 500 Mikrolitern 1x-Bindungspuffer ausgeglichen. Erhöhen Sie das Zellvolumen auf 500 Mikroliter mit 1x Bindungspuffer. Nach dem Austausch des Sammelrohrs wird die Zellsuspension auf die Säule aufgetragen und der Durchfluss in der neuen 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre aufgenommen.

Anschließend wird die Säule zweimal mit 500 Mikrolitern Bindungspuffer gewaschen und der Durchfluss in derselben Mikrozentrifugenröhre aufgefangen. Zentrifugieren Sie das Eluat bei 300 g für 10 Minuten und entsorgen Sie den Supernatanten. Zähle die Zellen und beurteile erneut die Lebensfähigkeit mit Trypan-Blau-Ausschluss.

20.000 lebensfähige Zellen in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstandsmittel. Die Zellen werden mit 40 Mikrolitern PBS mit 0,04 % BSA wieder suspendiert.

Schließlich legen Sie das Rohr mit den Zellen auf Eis und schicken Sie es sofort an eine genomische Kernanlage zur Bibliothekserzeugung und -sequenzierung. Sammeln Sie die Sequenzierungsergebnisse im Format der Zellranger-Ausgänge. Getrocknete Blutfleckproben von Frühgeborenen und Kontrollpersonen wurden verarbeitet.

Und die normalisierte Proteinexpression von 92 immunbezogenen Proteinen wurde quantifiziert. Die Expression des lymphozytenaktivierenden Gens drei und des signalisierenden schwellenwertregulierenden transmembranen Adapters 1 war im peripheren Blut von Frühgeborenen im Alter von zwei Monaten signifikant höher als im Terminblut der Nabelschnur. Eine umfassende Gating-Strategie wurde verwendet, um Leukozytenpopulationen aus roten Blutchen-lysierten weißen Blutkörperchenproben zu identifizieren.

Innerhalb der T-Zell-Population wurden CD4-positive und CD8-positive Untergruppen unterschieden. Nach dem Filtern wurden über 120.000 Zellen erfasst und im Einzelzell-Ribonukleinsäure-Sequenzierungsdatensatz profiliert. Dimensionsreduktion und Clustering-Analyse identifizierten 14 verschiedene Zellcluster.

Zellcluster wurden anhand unterschiedlich exprimierter Gene und bekannter Zellmarker annotiert. 12 der 14 Cluster entsprachen Immunzelllinien, darunter T-Zellen, natürliche Killerzellen, B-Zellen, myeloide Zellen und Neutrophile. Ein gestapeltes Balkendiagramm zeigte den relativen Anteil der Zellen pro Cluster über ein Woche, einen Monat und zwei Monate hinweg.

Diese Studie ermöglicht die Messung zellulärer, transkriptomer, proteomischer und funktioneller Immunsignaturen longitudinal aus Blutproben mit begrenztem Volumen. Zukünftige Studien können diese Methoden nutzen, um gesunde Immunverläufe zu definieren und dysregulierte frühe Immunantworten im frühen Leben im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.