Kartierung der Infant-Immunität mit minimalem Input: Integratives Einzelzell- und multiomisches Profiling
3. April 2026
Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme und Erhaltung von Blutproben von neonatalen und pädiatrischen Patienten sowie die Anwendung von scRNA-seq, Proteomik und spektraler Flowzytometrie zur Charakterisierung der Immunzellpopulationen aus diesen Proben.
Unsere Forschung definiert, wie sich die Immunität im frühen Leben nach der Geburt anpasst, indem wir longitudinales hochdimensionales multiomisches Profiling aus kleinen Blutvolumen verwenden. Dieses Protokoll kann auf neonatale und pädiatrische Studien zur longitudinalen Immunprofilierung aus begrenzten Bioproben über Gesundheit, Infektion und Entzündung angewendet werden. Zunächst tauen Sie schnell ein Fläschchen mit lysierten roten Säuglingsblutkörperchen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf.
Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein 15-Milliliter-konisches Rohr mit 10 Millilitern warmem, vollständigem RPMI-Medium bei 37 Grad Celsius. Zentrifugiere das Rohr bei 400 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entsorge das Überlagerungsmittel. Das Zellpellet in drei Millilitern vollständigen RPMI-Medium wieder suspendieren und die Gesamtzahl der Zellen zählen.
Verdünnen Sie die Probe, wenn die Konzentration zu hoch zum Zählen ist. Nach dem Zählen der Zellen wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und suspendieren Sie die Zellen erneut in einem vollständigen RPMI-Medium, um eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter zu erhalten. Bringen Sie 100 Mikroliter mit 0,1 Millionen Zellen in jede Öffnung einer 96-Well-V-Bodenplatte.
Zentrifugiere die Platte mit 764 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorge das Supernatant. Als Nächstes geben Sie 100 Mikroliter lebende tote Farbstoff, verdünnt von einem auf 2.000 in PBS mit FC-Block und Monocytenblock verdünnt von 100 bis 100 Proben außer der unverfärbten Kontrolle dazu.
Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Zum Waschen der Zellen geben Sie 100 Mikroliter PBS dazu. Zentrifugiere die Platte bei 764 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge vorsichtig das Supernatantum.
Fügen Sie 100 Mikroliter Oberflächenantikörpercocktail, verdünnt von einem bis 200 in fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer, zu allen Proben außer der unverfärbten Kontrolle hinzu. Brüte 30 Minuten bei vier Grad Celsius aus. Anschließend werden die Zellen mit 100 Mikrolitern FACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert und das Übersetzungsmittel entsorgt.
Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzufügen. 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann die Zellen erneut waschen und in 200 Mikrolitern FACS-Puffer erneut suspendieren. Bereiten Sie UltraComp-Kompensationsperlen als einfarbige Steuerungen vor.
Färben Sie die einfarbigen Kontrollperlen nach demselben Verfahren wie die Proben, einschließlich der Fixierung, wenn die Proben fixiert waren. Bereite außerdem Fluoreszenz minus eins oder FMO-Kontrollen auf dieselbe Weise vor. Führen Sie die Proben, einfarbige Kontrollen, unverfärbte Kontrollen und fluoreszierende Minus-eins-Kontrollen mit einem herkömmlichen oder spektralen Durchflusszytometer durch.
Öffnen Sie FlowJo und wählen Sie die zu analysierende Probe aus. Stellen Sie die Gatter mit geeigneten Isotyp- und FMO-Kontrollen ein. Gate-Leukozyten mit FSC versus SSC, um Ablagerungen auszuschließen, und Zellen nach Größe und Granularität auswählen.
Doublets mit FSCA statt FSCH ausschließen. Gate lebende Zellen mit einem Viabilitäts-Farbstoff, um tote Zellen auszuschließen. Aus lebenden Einzelzellen teilen sie sich in CD33-negative Lymphozyten und CD-33-positive myeloide Zellen.
In CD33-positiven Zellen werden CD14-positive Monozyten identifiziert. Anschließend identifizieren Sie in CD33-positiven Zellen CD14-negative, CD11C-positive dendritische Zellen. Jetzt gehen CD33-negative Lymphozyten CD3-positive T-Zellen und CD3-negative, CD56-positive natürliche Killerzellen.
Innerhalb von CD3-positiven T-Zellen identifizieren Sie CD8-positive und CD4-positive Untergruppen sowie CD3-negative, CD56-negative und CD19-positive B-Zellen. Zunächst tauen Sie ein Fläschchen mit kryokonservierten roten Blutkörperchen-lysierten Zellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-konisches Rohr mit 10 Millilitern T-Zell-Medien und zentrifugieren Sie bei 430 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorge das Supernatant. Nachdem das Zellpellet mit einem Milliliter PBS erneut suspendiert wurde, geben Sie der Probe weitere neun Milliliter PBS hinzu. Zentrifugiere das Rohr bei 430 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant.
Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit mit Trypan-Blau-Ausschluss. Wenn die Lebensfähigkeit unter 70 % liegt, verwenden Sie wie folgt ein Kit zur Entfernung toter Zellen. Zuerst bereiten Sie den 1x-bindenden Puffer vor, indem Sie die 20-fach-bindende Pufferlösung mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser verdünnen.
Setzen Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter Mikroperlen zur Entfernung toter Zellen pro 10 Mal in der Potenz von insgesamt sieben Zellen auf. Gut mischen und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Setzen Sie die magnetische Trennsäule zusammen mit einem Sammelrohr in den entsprechenden magnetischen Halter.
Anschließend wird die Säule durch Spülen mit 500 Mikrolitern 1x-Bindungspuffer ausgeglichen. Erhöhen Sie das Zellvolumen auf 500 Mikroliter mit 1x Bindungspuffer. Nach dem Austausch des Sammelrohrs wird die Zellsuspension auf die Säule aufgetragen und der Durchfluss in der neuen 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre aufgenommen.
Anschließend wird die Säule zweimal mit 500 Mikrolitern Bindungspuffer gewaschen und der Durchfluss in derselben Mikrozentrifugenröhre aufgefangen. Zentrifugieren Sie das Eluat bei 300 g für 10 Minuten und entsorgen Sie den Supernatanten. Zähle die Zellen und beurteile erneut die Lebensfähigkeit mit Trypan-Blau-Ausschluss.
20.000 lebensfähige Zellen in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstandsmittel. Die Zellen werden mit 40 Mikrolitern PBS mit 0,04 % BSA wieder suspendiert.
Schließlich legen Sie das Rohr mit den Zellen auf Eis und schicken Sie es sofort an eine genomische Kernanlage zur Bibliothekserzeugung und -sequenzierung. Sammeln Sie die Sequenzierungsergebnisse im Format der Zellranger-Ausgänge. Getrocknete Blutfleckproben von Frühgeborenen und Kontrollpersonen wurden verarbeitet.
Und die normalisierte Proteinexpression von 92 immunbezogenen Proteinen wurde quantifiziert. Die Expression des lymphozytenaktivierenden Gens drei und des signalisierenden schwellenwertregulierenden transmembranen Adapters 1 war im peripheren Blut von Frühgeborenen im Alter von zwei Monaten signifikant höher als im Terminblut der Nabelschnur. Eine umfassende Gating-Strategie wurde verwendet, um Leukozytenpopulationen aus roten Blutchen-lysierten weißen Blutkörperchenproben zu identifizieren.
Innerhalb der T-Zell-Population wurden CD4-positive und CD8-positive Untergruppen unterschieden. Nach dem Filtern wurden über 120.000 Zellen erfasst und im Einzelzell-Ribonukleinsäure-Sequenzierungsdatensatz profiliert. Dimensionsreduktion und Clustering-Analyse identifizierten 14 verschiedene Zellcluster.
Zellcluster wurden anhand unterschiedlich exprimierter Gene und bekannter Zellmarker annotiert. 12 der 14 Cluster entsprachen Immunzelllinien, darunter T-Zellen, natürliche Killerzellen, B-Zellen, myeloide Zellen und Neutrophile. Ein gestapeltes Balkendiagramm zeigte den relativen Anteil der Zellen pro Cluster über ein Woche, einen Monat und zwei Monate hinweg.
Diese Studie ermöglicht die Messung zellulärer, transkriptomer, proteomischer und funktioneller Immunsignaturen longitudinal aus Blutproben mit begrenztem Volumen. Zukünftige Studien können diese Methoden nutzen, um gesunde Immunverläufe zu definieren und dysregulierte frühe Immunantworten im frühen Leben im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.
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Übersicht
In diesem Artikel werden optimierte Protokolle für die hochdimensionale Immunprofillierung bei Neugeborenen mit minimalen Blutvolumina vorgestellt. Durch die Integration fortschrittlicher Techniken wie der Durchflusszytometrie, Proteomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglicht die Studie eine umfassende longitudinale Analyse der immunologischen Entwicklung im Neugeborenenalter, auch bei extrem geringem Geburtsgewicht oder Frühgeborenen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Neonatale und pädiatrische Forschung
- Einzelzellanalyse
Hintergrund
- Das neonatale Immunsystem passt sich rasch an eine neue, reizreiche Umgebung nach der Geburt an.
- Die Immunität in der frühen Lebensphase ist einzigartig auf die Entwicklungsbedürfnisse zugeschnitten und nicht einfach nur unreif.
- Die Untersuchung der neonatalen Immunität ist aufgrund des begrenzten für die Forschung verfügbaren Blutvolumens herausfordernd.
- Eine umfassende Immunprofillierung erfordert Methoden, die aus kleinen Proben ein Höchstmaß an Daten gewinnen.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Demonstration von Protokollen zur hochdimensionalen Immunprofillierung aus geringen neonatalen Blutproben.
- Möglichmachung longitudinaler Studien zur Immunentwicklung bei Neugeborenen und Frühgeborenen.
- Erfassung zellulärer, transkriptomischer und proteomischer Immunsignatur über die Zeit hinweg.
Verwendete Methoden
- Auftauen und Verarbeitung von lysierten roten Blutkörperchenproben von Neugeborenen.
- Durchflusszytometrie mit detaillierten Gating-Strategien zur Identifizierung von Immunzellpopulationen (T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, myeloide Zellen, dendritische Zellen, Monozyten, Neutrophile).
- Proteomische Analyse von getrockneten Blutfleckenproben zur Quantifizierung von 92 immunbezogenen Proteinen.
- Einzelzell-RNA-Sequenzierung mit Ausschluss toter Zellen, Bibliotheksherstellung und Clusteranalyse von über 120.000 Zellen.
- Langzeitprobenahme zu mehreren Zeitpunkten (eine Woche, ein Monat, zwei Monate).
Hauptergebnisse
- Protokolle ermöglichten das Immunprofil aus sehr geringen Blutvolumina, die für Neugeborene und Frühgeborene geeignet sind.
- Signifikant höhere Expression des Lymphozytenaktivierungsgens drei und des signalregulierenden transmembranen Adapters 1 bei Frühgeborenen im Alter von zwei Monaten im Vergleich zum Nabelschnurblut von reifgeborenen Säuglingen.
- Identifizierung und Annotation von 14 verschiedenen Zellclustern, wobei 12 diesen bekannten Immunlinien entsprechen.
- Visualisierung dynamischer Veränderungen der Anteile von Immunzellen während der frühen Lebensabschnitte.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebenen Methoden ermöglichen ein umfassendes, longitudinales Immunprofil aus begrenzten neonatalen Blutproben.
- Diese Ansätze erleichtern die Untersuchung der gesunden Immunentwicklung sowie die Identifizierung dysregulierter Reaktionen, die mit Erkrankungen assoziiert sind.
- Die Protokolle sind breit anwendbar in der neonatalen und pädiatrischen Immunforschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das integrative Einzelzell- und Multiom-Profilen aus minimalen neonatalen Blutvolumina ermöglicht beispiellose Einblicke in die Immunentwicklung in der frühen Lebensphase und überwindet dabei kritische Probeneinschränkungen in der pädiatrischen Forschung. Dieser Ansatz unterstützt die hochauflösende Kartierung immunologischer Verläufe und liefert damit Grundlagen für die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominimierung in den frühesten Stadien der menschlichen Immunität. Die Protokolle ermöglichen eine longitudinale, quantitative Immunüberwachung und beeinflussen somit unmittelbar Entscheidungen in der translationalen Pipeline für pädiatrische und neonatale Therapieprogramme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von Immunzellpopulationen und -wegen bei Neugeborenen unter Verwendung minimaler Biospezimen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem transkriptomische und proteomische Signaturen über verschiedene Entwicklungszeitpunkte erfasst werden.
- Bietet eine mechanistische Entlastung für Programme zur pädiatrischen Immunologie, indem einzigartige immunologische Anpassungen des frühen Lebensabschnitts aufgedeckt werden.
- Erleichtert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielstrukturwahl für neonatale und pädiatrische Indikationen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte, reproduzierbare Arbeitsabläufe zur Identifizierung und Quantifizierung von Immunzellen aus Proben geringer Menge.
- Standardisiert Torgate- und Kontrollstrategien für die Durchflusszytometrie und gewährleistet damit Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit des Assays.
- Ermöglicht skalierbare, hochdimensionale Untersuchungen von Immunphänotypen und Proteinexpressionsprofilen.
- Bereitet robuste biologische Systeme für die nachgeschaltete Evaluierung von Verbindungen und die Entdeckung von Biomarkern vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Ergebnisse der Immunprofilerstellung mit krankheitsrelevanten pädiatrischen und neonatalen Modellen.
- Unterstützt die Entdeckung und Validierung von Biomarkern über einen längeren Zeitraum hinweg zur Früherkennung immunologischer Regulationsstörungen im Säuglingsalter.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem wiederholte Probenahmen und Analysen ermöglicht werden.
- Verringert das Risiko bei der translationellen Weiterentwicklung, indem gesunde und gestörte Immunverläufe bei Säuglingen abgebildet werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese integrative Profilierungsmethode verbindet frühe Entdeckung, Screening und translationale Forschung, indem sie eine umfassende Immunanalyse aus begrenzten neonatalen Proben ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen im Zusammenhang mit der Immunität in der frühen Lebensphase.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Messungen von Immunzellen und Proteinen, die für Hochdurchsatz-Arbeitsabläufe geeignet sind.
- Analytik: Bietet multiomische Messgrößen und statistische Auswertungen zur robusten Vergleichbarkeit von Entwicklungs- und Krankheitszuständen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern und die risikoadjustierte Weiterentwicklung in pädiatrischen und neonatalen Programmen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, skalierbare Plattform zur Immunprofillierung über verschiedene pädiatrische Forschungsinitiativen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in der pädiatrischen Immunforschung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Immunprofilerstellung aus minimalem Probenvolumen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem hochinformative Daten aus begrenzten Proben gewonnen werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung pädiatrischer und neonataler therapeutischer Wirkstoffe.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Durchflusszytometrie, der Einzelzell-RNA-Sequenzierung und der Analyse von Proteomdaten.
- Benötigt Zugang zu fortschrittlichen Geräten und einer Bioinformatik-Infrastruktur zur Integration multiomischer Daten.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung der Probenvorbereitung, des Gatings und der Kontrollstrategien zwischen den Teams.
- Anpassbar an verschiedene pädiatrische und neonatale Modellsysteme bei entsprechender Protokolloptimierung.
- Eingeschränkt durch den Bedarf an spezialisierten Reagenzien sowie Unterstützung durch zentrale Einrichtungen für Sequenzierungs- und Proteomikanalysen.
