Eine Technik zur Stabilisierung von Membranproteinen in Nanodiscs

Dieses Protokoll hebt einen reproduzierbaren Nanodisc-Rekonstitutions-Workflow mit einem generierten Methoden-Framework hervor. Detergente destabilisieren die Membranproteine. Nanodiscs mit MSPs und Lipiden nehmen die native Struktur für Kryo-EM und Lyse wahr.

Beginnen Sie damit, die in Chloroform hergestellten Lipidkomponenten in ein Glasreagenzglas zu geben, um eine 100-Mikroliter-Lipidmischung herzustellen und gründlich zu mischen. Verdampfen Sie das Chloroform unter einem sanften Strom aus Stickstoffgas, bis die gesamte Flüssigkeit entfernt ist. Geben Sie etwa zwei Milliliter N-Pentan tropfweise in das Glasreagenzglas und verdampfen Sie das Lösungsmittel mit Stickstoffgas, um einen trockenen, transparenten Lipidfilm zu erhalten.

Nachdem Sie den Schlauchdeckel gelockert haben, setzen Sie das Rohr in den Vakuumaustrockner. Entfernen Sie den Desiccator und halten Sie ihn unter Vakuum, um eventuelle Restlösungsmittel zu entfernen. Dann entferne die Lipidschicht aus dem Vakuum-Desiccator und gib 250 Mikroliter waschenfreien, salzarmen Puffer hinzu, um den Lipidfilm zu hydratisieren, was eine endgültige Lipidkonzentration von 10 Milligramm pro Milliliter ergibt.

Nach dem Resuspendieren des Lipids gleichmäßig in vier Glasröhren aufteilen. Sonikieren Sie die Suspensionen, bis sie klar und transparent sind, was auf eine erfolgreiche Liposomenbildung hinweist. Spülen Sie dann sofort den Kopfraum jedes Rohrs mit Stickstoffgas und lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius bis zum Gebrauch.

Nach der Umwandlung der E.coli BL21-Zellen mit dem MSP1D1-Plasmid, das ein 7-Hisidin-Tag trägt, und anschließend wächst die Kultur. Induzieren Sie die MSP-Expression durch Hinzufügen von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,5 bis einem Millimolar. Anschließend kultivieren Sie die Zellen weiterhin bei 16 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden mit Schütteln.

Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant und behalten Sie das Zellpellet. Anschließend wird das aus einem Liter Kultur gewonnene Pellet in 100 bis 150 Millilitern Lysepuffer wieder suspendiert.

Homogenisieren Sie gründlich, bis eine gleichmäßige Suspension ohne sichtbare Klumpen erreicht ist. Anschließend verwenden Sie einen gekühlten Ultraschallzell-Disruptor, um die Bakterien mit 35 % Leistung zu brechen, mit Zyklen von dreisekündigen Pulsen, gefolgt von sechssekündigen Pausen. Setzen Sie die Sonication fort, bis das Lysat klar und hellbraun ist.

Zentrifugieren Sie das Lysat bei 30.000 g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie das Supernatant für die folgenden Schritte. Nach der Inkubation des Supernatanten mit ausgeglichenem Nickel-NTA-Harz und dem Waschen zur Entfernung von Verunreinigungen wird das Zielprotein mit dem Eluationspuffer elutiert und die Eluatfraktionen gesammelt. Sammeln Sie weiterhin Fraktionen, bis die Absorption des Eluats bei 280 Nanometern unter 0,01 fällt.

Dann gibt es das gesammelte Eluat in den Dialyseschlauch und dialysiert es über Nacht mit sanftem Rühren gegen den Dialysepuffer bei vier Grad Celsius. Nach der Dialyse wird die Lösung mit einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert, um eine endgültige MSP-Konzentration von zwei bis fünf Milligramm pro Milliliter zu erhalten. Wiege etwa 250 Milligramm Bioperlen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.

Gib 25 bis 30 Milliliter Methanol in das Rohr. Drehen oder wirbeln Sie die Mischung im Dunkeln gründlich. Nach dem 20-minütigen Inkubieren des Röhrchens bei vier Grad Celsius werfen Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig weg und wiederholen Sie das Methanol-Waschen noch zweimal.

Führen Sie ähnliche Waschphasen dreimal mit doppelt destilliertem Wasser durch und geben Sie dann 25 bis 30 Milliliter waschmittelfreien, salzarmen Puffer zu den Perlen. Schütteln oder drehen Sie das Rohr auf einem rotierenden Tisch, um zu mischen und zu inkubieren, wie bereits gezeigt. Verwerfen Sie das Überlagerungsmittel und wiederholen Sie den Salzarm-Puffer-Gleichgewichtsschritt dreimal, um die Perlen vollständig zu konditionieren.

Teilen Sie die aktivierten Bioperlen gleichmäßig in drei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhren auf, um sie weiter zu verwenden. Nehmen Sie einen Aliquot des vorgefertigten Lipidbestands und tauen Sie ihn auf. Zentrifugieren Sie das Rohr sofort bei 7.000 g für fünf Sekunden bei vier Grad Celsius, um den Inhalt am Boden aufzusammeln.

Ultraschallen Sie das Lipidmaterial in einem Wasserbad mit 60 % Amplitude und überwachen Sie alle fünf bis zehn Minuten die Klarheit und Temperatur, um Überhitzung zu vermeiden. Setzen Sie die Sonikation fort, bis der Lipidstock klar und transparent ist. Berechnen Sie die molare Menge des Zielmembranproteins mit der dargestellten Gleichung.

Berechnen Sie anschließend die erforderlichen Mengen an MSP- und Lipidlagerlösungen basierend auf einem molaren stöchiometrischen Verhältnis von Zielprotein zu MSP zu Lipid von eins bis fünf bis 250. Kombinieren Sie die entsprechenden Mengen an Lipid und MSP, um eine 300-Mikroliter-Mastermischung herzustellen, und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Dann gibt man langsam 50 Mikroliter der Mischung zur konzentrierten Proteinlösung und pipettert sanft, um die Homogenität zu gewährleisten.

Dann legen Sie die Mischung eine Stunde lang auf Eis und wenden Sie das Rohr alle 15 Minuten vorsichtig um, um gründlich zu vermischen. Nehmen Sie nun einen Aliquot der voraktivierten Bioperlen und saugen Sie den restlichen salzarmen Puffer an. Gib die Proteinlösung zu den Perlen und inkubiere sie eine Stunde lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius.

Zentrifugiere die Mischung bei 7.000 g für fünf Sekunden bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie vorsichtig den Überstandsstoff auf einen zweiten Aliquot von Bioperlen, aus dem der salzarte Puffer aspiriert wurde. Nachdem du den Inhalt gut durch sanfte Inversion gemischt hast, brütet man vier bis acht Stunden im Dunkeln oder über Nacht.

Sobald die Proteinlösung kurz zentrifugiert ist, wird das Supernatant auf den dritten Aliquot der voraktivierten Bioperlen übertragen. Inkubieren Sie mit einer Rotation von vier Grad Celsius im Dunkeln für eine Stunde. Nach einer kurzen Zentrifugation wird das Überstandsmittel in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr überführt.

Zentrifugiere bei 17.000 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um Aggregate zu entfernen. Nach der Reinigung der Nanodisc-TASK2-Komplexe mittels Größenausschlusschromatographie werden die Spitzenfraktionen aus der Elution zusammengefasst und zu einer endgültigen Nanodisc-TASK2-Konzentration von 1,2 bis 1,5 Milligramm pro Milliliter konzentriert. Um die Nanodisc-Assemblierung zu überprüfen, analysieren Sie die Proben mit 12%SDS-PAGE und bestätigen das Vorhandensein von MSP und Zielmembranprotein.

Das Größenausschlusschromatographieprofil zeigte zwei Hauptspitzen, die dem zusammengesetzten Nanodisc-Komplex mit 15,1 Millilitern und freiem MSP bei 18,0 Millilitern entsprechen. Die Quantifizierung der Peakflächen zeigte, dass der zusammengesetzte Nanodisc-Peak eine Fläche von 147,2 hatte. Im Gegensatz dazu hatte der Free-MSP-Peak eine Fläche von 31,5, was einer Assemblierungseffizienz von 82,4 % entspricht – die Komigration des Zielproteins und MSP in SDS-PAGE bestätigte ihre Integration in einen einzelnen Nanodisc-Komplex.

Dieses Protokoll hilft Forschern, die Membranproteinstruktur mithilfe der Nanodisc-Array-Konstitution zu untersuchen. Der schwierigste Teil besteht darin, das Verhältnis von Membranprotein, MSP und Lipiden zu optimieren. Funktionelle Tests, Oberflächenplasmonresonanz und Massenspektrometrie können ebenfalls mit diesem Verfahren durchgeführt werden.