Ein Hypoxie-Reoxygenierungs-Verletzungsmodell bei selbstassemblierenden menschlichen Kardioiden

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, neue Wege zu finden, um das Herz nach einer Verletzung zu regenerieren. Dafür erzeugen wir selbstassemblierende kardiale Organoide und führen Hypoxiereoxygenierungsstudien durch. Dieses Protokoll kann zur Untersuchung der Verletzungsreaktion, therapeutischen Interventionen zur Förderung der Regeneration angewendet werden und kann für patientenspezifische Krankheitsmodellierungen eingesetzt werden.

Zu Beginn aspirieren Sie das D1-Herzmesoderm-Spezifikationsmedium und fügen Sie genügend Zellablösungslösung hinzu, um die vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Herzmesodermzellen vollständig abzudecken. Dann stellen Sie die Platte für fünf Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Mit einer Pipette geben Sie jedem Brunnen ein gleiches Volumen D2-Herzmesoderm-Medium und pipieren Sie vorsichtig auf und ab, um die adhärenten Zellen freizusetzen, und übertragen die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-konisches Rohr.

Mit einer Zentrifuge pelletieren Sie die Zellen bei 300 G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter D2-Herzmesoderm-Spezifikationsmedium, das fünf mikromolare IWP-2 und 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure in RB minus enthält. Mische 10 Mikroliter Trypanblau mit 10 Mikrolitern der Zellsuspension in einem Mikrorohr.

Zählen Sie die Zellen mit der bevorzugten Zählmethode und verdünnen Sie sie dann auf eine Konzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter in D2-Herzmesoder-Spezifikationsmedien, ergänzt mit zwei mikromolaren Thiazovivin. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein entsprechend großes Reagenzienreservoir. Anschließend gibt man mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jede Mulde einer ultraniedrigen 96-Well-Platte, um eine Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Bohrloch zu erreichen.

Drehen Sie die Platte bei 500 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Bildung menschlicher kardialer Organoide in der Suspensionskultur zu induzieren. Beobachten Sie die Bildung eines großen, gut abgegrenzten Zellpellets in jedem Brunnen. Wenn das Pellet nicht begrenzt ist, wird die Zentrifugation wiederholt.

Nach 24 Stunden bereiten Sie 10 Milliliter D3-Medium vor, die fünf mikromolare IWP-2 und 50 Mikrogramm Ascorbinsäure pro Milliliter in RB minus pro Platte enthalten. Mit einer Mehrkanalpipette fügen Sie 100 Mikroliter D3-Medien zu jedem Brunnen hinzu, ohne vorhandene Medien zu entfernen. Am nächsten Tag entfernen Sie 100 Mikroliter D3-Medium aus jedem Brunnen.

Um das Aspirationsrisiko zu minimieren, neigen Sie die Platte in einen 45-Grad-Winkel und halten Sie eine Mehrkanalpipette in einem 90-Grad-Winkel zur Seitenwand der Platte. Setzen Sie die Pipette fest an die Wand des Brunnens und aspirieren Sie langsam. Nach dem Entfernen des Mediums wird es durch 100 Mikroliter D4-Medien ersetzt, die fünf mikromolare IWP-2 in RB minus enthalten.

Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette ohne abgetrennte Spitze werden die menschlichen kardialen Organoide in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Lassen Sie die Organoide auf den Boden des Rohrs sinken und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medien. Fügen Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um die Organoide einmal zu waschen.

Warte ein paar Sekunden, bis sie eingesackt sind, und entferne vorsichtig das überschüssige PBS. Als Nächstes fügen Sie 4 % Paraformaldehyd hinzu, um die Organoide zu fixieren, und stellen Sie das Rohr 30 Minuten bei Zimmertemperatur, um die Fixierung zu ermöglichen. Dann wird die gewünschte Anzahl fixierter Organoide in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.

Entfernen Sie die Fixationslösung und waschen Sie die Organoide mit PBS mit 0,1 % Tween 20. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den Antikörper auf die gewünschte Konzentration in der Färbelösung verdünnen. Mit einer Pipette geben Sie 50 bis 100 Mikroliter der primären Antikörperlösung zu jedem Mikrozentrifugenrohr, wobei die Organoide vollständig bedeckt sind.

Nach der Inkubation und anschließenden Wascharbeiten wird die Probe mit einem sekundären Antikörper betreut, der in Färbelösung verdünnt wurde, 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einer Schüttelplattform inkubiert. Nach dem Inkubation führen Sie Waschübungen wie zuvor beschrieben durch. Als Nächstes werden die Organoide mit einer geschnittenen Pipettenspitze auf einen positiv geladenen Glasträger übertragen.

Entferne vorsichtig überschüssiges PBS mit Tween 20 und gib ein paar Tropfen Montagemedium hinzu, um die Organoide zu bedecken. Leg vorsichtig einen Deckdeckel über die Organoide, um sie zu plattmachen. Anschließend führen Sie eine Fluoreszenzmikroskopie durch.

Nachdem Sie die fixierten Organoide über Nacht in 30 % Saccharose bei vier Grad Celsius inkubiert haben, geben Sie sie in eine Kunststoffform und geben Sie einen kleinen Tropfen optimalen Schneidetemperatur-Compound in die Form, gerade genug, um die Organoide zu bedecken. Mit einer feinen Pinzette oder einer Pipettspitze positionieren Sie die Organoide vorsichtig in der Verbindung, sodass sie nicht verklumpt sind und von den Rändern der Form entfernt sind. Positionieren Sie die Organoide so nah wie möglich am Boden der Form, um die Anzahl der vorhandenen Teile einer einzelnen Kryosektion zu maximieren.

Setzen Sie die Form in einen Styroporkühler, der eine Schicht Trockeneis enthält, um die erste Schicht des optimalen Schneidemittels einzufrieren. Warte ein paar Minuten, bis die Masse ausgehärtet ist, und stelle die Form dann auf die Arbeitsplatte. Fügen Sie zusätzlich eine optimale Schneidetemperatur hinzu, bis die Form gefüllt ist.

Lassen Sie die erste Schicht vollständig schmelzen, bevor Sie die Form wieder ins Trockeneis zurückbringen, um vollständig einzufrieren. Nach dem Einfrieren lagern Sie die Formen bei minus 80 Grad Celsius oder beginnen Sie mit der Kryosektion, um sechs Mikrometer Schnitte zu erhalten. Mit einer Pipette werden fünf Milliliter Hypoxie-Medium pro 96-Well-menschlicher kardialer organoider Platte in eine Zellkulturkolbe übertragen.

Platzieren Sie den Kolben in eine Hypoxiekammer und spülen Sie die Kammer drei Minuten lang mit anoxischem Gas, das aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Stickstoff besteht. Stellen Sie die Kammer mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator, bevor Sie Hypoxie einleiten. Mit einer Mehrkanalpipette werden etwa 150 Mikroliter Medium aus allen Öffnungen der menschlichen kardialen Organoidplatte entfernt.

Dann entferne mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig das verbleibende Medium aus jedem einzelnen Brunnen, ohne die Organoide zu stören. Fügen Sie jedem Brunnen 50 Mikroliter Hypoxie-Medium hinzu. Setzen Sie die organoide Platte des menschlichen Herzens in die Hypoxiekammer.

Und spülen Sie die Kammer drei Minuten lang mit anoxischem Gas, das aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Stickstoff besteht. Stellen Sie die Hypoxie-Kammer sechs Stunden lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die Reoxygenierung einzuleiten, werden die menschlichen kardialen Organoide aus der Hypoxiekammer entfernt.

Mit einer Mehrkanalpipette fügen Sie jedem Bohrloch 150 Mikroliter vorgewärmtes RB+-Medium hinzu. Schließlich wird die Platte bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator gelegt und mindestens drei Stunden Reoxygenierung erlaubt, bevor Analysen flussabwärts durchgeführt werden. Nach sechs Stunden Hypoxie und 24 Stunden Reperfusion war die extrazelluläre Laktatdehydrogenase-Aktivität bei verletzten menschlichen Herzorganoiden im Vergleich zu unverletzten Kontrollgruppen signifikant erhöht.

Die mit Hypoxie behandelten kardialen Organoiden zeigten TUNEL-positive Kardiomyozytenkerne, und der Anteil der TUNEL-positiven Kardiomyozytenkerne war bei verletzten Organoiden signifikant höher als bei unverletzten Kontrollen. Eine zeitabhängige Zunahme der Narbenbildung wurde mit der zunehmenden Dauer der Hypoxie vor der Reoxygenierung beobachtet. 24 Stunden nach der Reperfusion schlugen 69 % der unverletzten menschlichen kardialen Organoide, während keines der verletzten Organoide schlug.

Unverletzte menschliche kardiale Organoide wiesen synchronisierte Kalziumtransienten in fünf Interessensbereichen auf, wobei gleichzeitig Peaks und ähnliche Wellenformen auftraten. Verletzte menschliche Herzorganoide zeigten keine koordinierten Kontraktionen, sondern stattdessen unregelmäßige spontane Kalziumtransienten in interessierenden Regionen. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Myokardinfarkt bei iPSC-abgeleiteten menschlichen Herzorganoiden nachzuahmen.

Die größte technische Herausforderung bei der Sicherstellung reproduzierbarer Verletzungen ist die vollständige Entfernung vorhandener Medien. Unsere zukünftigen Studien zielen darauf ab, Faktoren zu identifizieren, die die Geweberegeneration in menschlichen kardialen Organoidmodellen fördern können.