Umwelt-DNA-Probenahme von Walbeobachtungsschiffen zur Überwachung von Walwalen

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Wal-eDNA-Entnahme während Walbeobachtungskreuzfahrten. Es sind viele verschiedene eDNA-Probemethoden verfügbar. Dies erschwert die vergleichende Datenanalyse.

Unser Protokoll wurde hinweg über Umweltbedingungen und Schutzmaßnahmen vor Verunreinigung optimiert. Mit Unterstützung eines eDNA-Radiolabors kann dieses Protokoll von Laien und Bürgerwissenschaftlern während Walbeobachtungen und weltweit durchgeführt werden. Zu Beginn bereiten Sie Felddokumentationsmaterialien vor, einschließlich der Felddatenblätter und des laminierten Schritt-für-Schritt-Protokolls für die Umwelt-DNA-Probenahme von Walen.

Lege einen wasserdichten Marker, zwei eDNA-Filter pro Flukeprint, genügend Handschuhe und einen speziellen Abfallbehälter in die Kiste. Bereiten Sie einen oder mehrere starren Eimer vor, die für den Schiffstyp und die Bordkonfiguration geeignet sind, einen sekundären Umwelt-DNA-Behälter sowie eine tragbare peristaltische oder Vakuumwasserpumpe. Tragen Sie Handschuhe bei allen Ausrüstungshandhabungen und wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Aufgaben.

Um die Ausrüstung zu sterilisieren, wenden Sie eine verdünnte Haushaltsbleichlösung auf, indem Sie gleichmäßig auf alle Oberflächen der Eimer, Deckel, Behälter und Pumpenschläuche spritzen. Dreimal gründlich mit Leitungswasser abspülen. Bringen Sie alle Materialien vor Ankunft der Passagiere an Bord und lagern Sie sie in einem ausgewiesenen, sauberen Bereich.

Koordinieren Sie den Zeitpunkt und die Positionierung der Probenahme des Schiffes mit der Besatzung. Beobachten Sie Oberflächenmuster im Wasser, um Waltauchgänge vorauszusehen. Sammeln Sie so schnell wie möglich 20 Liter Meerwasser aus dem Flukeprint und sorgen Sie für eine Verzögerung von nicht mehr als 10 Minuten nach den Waltauchgängen.

Entnehmen Sie Proben aus verschiedenen Regionen unter individuell angepassten logistischen Bedingungen für jeden Standort und Schiffstyp. Falls nötig, transportieren Sie das gesammelte Wasser zu einer ausgewiesenen Filterstation an Bord, um Verschüttungen zu vermeiden. Erfassen Sie die Artidentität, die Koordinaten des geografischen Positionssystems, die Zeit und die Identifikation der Proben im Datenblatt.

Wechsel die Handschuhe vor der Filtration. Öffne den Filterbeutel und halte den Filter nur am Auslass. Stecke den Einlass in den Schnorchel und verbinde dann das Pumpenrohr mit dem Auslass.

Tauchen Sie den Schnorchel in die Wasserprobe, ohne das Filtergehäuse zu untertauchen, und stellen Sie die Pumpe auf einen schnellen, gleichmäßigen Durchfluss. Filtern Sie kontinuierlich 10 Liter und überwachen Sie die Durchflussstabilität. Als Nächstes drehen Sie den Filter um und lassen die Pumpe 30 bis 60 Sekunden laufen, um das Restwasser zu entfernen.

Passen Sie die Filterpumpe an die Bedingungen des Feldes an. Schalte die Pumpe aus und trenne den Schlauch ab. Setze den Filter sofort in den Originalbeutel und beschrifte ihn.

Wechseln Sie die Handschuhe und bereiten Sie die Filtration für die zweite Replikation vor. Bewahren Sie die selbsterhaltenden Umwelt-DNA-Filter in einem sicheren, trockenen Behälter in einem schattigen Raum mit Umgebungstemperatur auf. Kühlen Sie die Filter, wenn die Umgebungstemperatur 20 Grad Celsius überschreitet, und versenden Sie sie innerhalb von drei Monaten.

Führen Sie alle Laborprozeduren in speziellen ultraviolett-sterilisierten Räumen mit ausreichender Belüftung durch. Nachdem Sie DNA-freie Handschuhe und Schutzkleidung angezogen haben, reinigen Sie die Werkbänke gründlich. Mit DNA-freien Pinzetten faltet man die Filtermembran in Dreiecke und überträgt sie in ein Zwei-Milliliter-Reaktionsrohr mit nach unten ausgerichteter Spitze.

Fügen Sie jedem Reaktionsröhrchen einen 400-Mikroliter-Lysispuffer mit 380 Mikrolitern TES-Puffer und 20 Mikrolitern Proteinase K hinzu. Vortex kurz und inkubieren bei 56 Grad Celsius für mindestens drei Stunden mit Bewegung. Setzen Sie den Filter in einen Kunststoffeinlass mit perforiertem Boden und zentrifugieren Sie bei 18.626 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um den Lysispuffer vom Filter zu trennen.

Pipettenextraktionsreagenzien in Waschplatten und Elutionsplatten. Verwenden Sie mehrere Bindeplatten, wenn das gesamte Lysatvolumen 300 Mikroliter übersteigt. Vortexmagnetische Partikel und 30 Mikroliter pro Bohrloch in die erste Bindeplatte hinzufügen.

Führen Sie das vorläufige DNA-Aufnahmeprogramm für zwei Bindplatten und das anschließende DNA-Extraktionsprogramm am Roboter durch. Um alle QPCR-Reaktionen in dreifacher Ausführung durchzuführen, bereiten Sie die erforderliche Mastermischung in einem dedizierten Arbeitsbereich vor und verteilen sie über die Brunnen. Geben Sie jedem Brunnen drei Mikroliter entweder des Ziel-DNA-Standards oder des eDNA-Extrakts.

Nach dem Abdichten der vorbereiteten PCR-Platte wird sie bei 3.500 G für 10 Sekunden zentrifugiert und die Platte in den Echtzeit-quantitativen PCR-Thermocycler eingeleitet. Führen Sie schließlich den Test unter optimierten Radfahrbedingungen durch. 247 Umwelt-DNA- oder eDNA-Proben wurden in der Skjalfandi-Bucht, Island, und auf den Azoren gesammelt, wobei bis zu 10 Liter Meerwasser mit zwei selbsterhaltenden eDNA-Filtern pro Flukeprint gesammelt wurden.

Von den 44 eDNA-Filtern, die für Buckelwal-eDNA analysiert wurden, lieferten 20 Amplifikationssignale, während 24 keine Amplifikation zeigten. Extraktionsrohlinge, Feldkontrollen und quantitative PCR-Kontrollen zeigten keine nachweisbare Amplifikation, was auf das Ausbleiben einer Kontamination hinweist. Unter den positiven Reaktionen ergaben neun eDNA-Filter mindestens einen Zyklus-Schwellenwert unterhalb der Nachweisgrenze und wurden als zuverlässige Nachweise eingestuft.

Die übrigen 11 EDNA-Filter erzeugten Zyklusschwellenwerte über dem Nachweisgrenze, was auf plausible Nachweise hinweist. Der mittlere Zyklusschwellenwert war bei den Azoren-eDNA-Filtern mit etwa 34,7 geringfügig niedriger als bei den Island-Filtern mit einem Wert von etwa 36,9. Der Unterschied in den Zyklus-Schwellenwerten zwischen den eDNA-Filtern der Azoren und Island war statistisch nicht signifikant.

Dieses Protokoll kann für zukünftige groß angelegte eDNA-Probenahmekampagnen zur Untersuchung der marinen Biodiversität oder der Genetik der Walpopulationen verwendet werden. Dieses Protokoll ermöglicht den nicht-invasiven Nachweis und die Überwachung von Walen und gleichzeitig vorkommende Taxa mittels eDNA, die in Flukeprints von Walbeobachtungsschiffen enthalten ist.