Erzeugung des frühgestationalen mütterlichen Immunaktivierungsmodells zur Beurteilung pränataler Entzündungen auf die Neuroentwicklung

Unser Labor untersucht, wie pränatale Entzündungen die Biologie der Mikroglia verändern, also der Immunzellen des Gehirns, die zu negativen neuroentwicklungsbedingten Ergebnissen beitragen. Bestehende MI-Modelle konzentrieren sich auf die mittlere Schwangerschaft. Wir präsentieren jedoch ein frühes Gestationsprotokoll, das zudem Qualitätskontrollkennzahlen einbezieht, um Überlebensfähigkeit und Konsistenz zu verbessern.

Das Modell kann auf jedes Wildtyp- oder genetische Mausmodell angewendet werden, um die Auswirkungen von Umweltentzündungen auf die Gehirnentwicklung zu untersuchen. Zu Beginn stellen Sie zwei acht bis zehn Wochen alte C57 BL6 weibliche Mäuse mit C57 BL6 Züchtermännchen am späten Nachmittag oder Abend auf. Am nächsten Morgen untersuchen Sie die weiblichen Mäuse auf Vaginalplugs und kontrollieren Sie sie einmal täglich, bis das Verstopfen erfolgt.

Die Stecker sind temporär und können bis zum Nachmittag herausfallen, wenn sie morgens nicht überprüft werden. Nach der Bestätigung eines vaginalen Plugs wiegen Sie die weibliche Maus und zeichnen Sie das Gewicht auf, um den Schwangerschaftsstatus zu überwachen, indem Sie die Gewichtszunahme während der Schwangerschaft verfolgen. Trennen Sie die Weibchen in einzelne Käfige und halten Sie sie unter normalen Unterbringungsbedingungen mit Ad-Libidum-Zugang zu Futter und Wasser.

Setze verstopfte Weibchen als Embryonaltag 0,5 an und notiere das Datum des Vaginalplugs, um das Gestationsalter genau zu verfolgen. Um lyophilisiertes Poly-IC zu einer hochkonzentrierten Stocklösung wiederherzustellen, lösen Sie es gemäß den Anweisungen des Herstellers in steriler Kochsalzlösung oder sterilem Wasser auf. Vortex die hochkonzentrierte Lagerlösung.

Anschließend verdünnen Sie die Lösung in Kochsalzlösung, um eine Fond mit niedriger Konzentration herzustellen. Um wiederholte Gefrier-Tauzyklen zu vermeiden, werden etwa 125 Mikroliter des niedrig konzentrierten Materials in 1,5-Milliliter-Röhren gelagert und bei 20 Grad Celsius oder 80 Grad Celsius gelagert. Unmittelbar vor der Injektion am Embryonaltag 9,5.

Verdünnen Sie den niedrigkonzentrierten Poly-IC-Bestand mit steriler Kochsalzlösung, um eine Arbeitskonzentration zu erzielen. Erhitze das Arbeitsmaterial bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten, um eine ordnungsgemäße Neuanalung der doppelsträngigen Ribonukleinsäurestruktur sicherzustellen. Dann wirbeln oder pipettieren Sie die Lösung, um vor der Injektion eine homogene Mischung zu gewährleisten.

Um die Schwangerschaft zu bestätigen, wiegen Sie den Damm am Morgen des Embryonaltages 9,5. Berechnen Sie das Poly-IC-Injektionsvolumen für die mütterliche Immunaktivierung, oder MIA, sowie das 0,9%-Salzinjektionsvolumen für Kontrollen. Ziehen Sie das entsprechende Volumen der vorbereiteten Poly-IC-Arbeitslösung oder Kochsalzlösung in eine sterile Spritze mit 27 Gauge oder kleiner.

Jetzt sollten Sie den Damm richtig fixieren, um Schmerz und Belastung zu minimieren. Injizieren Sie die Poly-IC-Säure oder Kochsalzlösung intraperitoneal im unteren linken oder rechten Quadranten direkt oberhalb der Hüfte oder an der zweiten Brustwarzengruppe. Dann entsorgen Sie die Spritzen in einem BioSafety Sharps-Behälter.

Zeichnen Sie außerdem die Injektionsseite auf, um die Konsistenz über die gesamte Kohorte zu gewährleisten. Bringen Sie den Damm sofort zurück in den Hauskäfig und beobachten Sie auf Anzeichen von Stress. Anschließend sollte man den Käfig mindestens 24 Stunden nach der Injektion mit Hydrogel ergänzen, um Dehydrierung im Zusammenhang mit Krankheitsverhalten zu verhindern.

Danach werden das Poly-IC-Dosisvolumen, Injektionsdatum und -zeit, das Gestationsalter und die Poly-IC-Lotnummer notiert. Drei Stunden nach der Injektion beobachten Sie jede Maus einzeln für eine Minute und beurteilen Sie Verhaltensweisen wie verminderte Aktivität, gekrümmte Haltung, Gesichtsgrimassen oder wässrigen Stuhl mit einer Dreipunktskala. Klassifizieren Sie Mäuse, die eines oder mehrere dieser Verhaltensweisen zeigen, als akut Krankheitsverhalten.

Anschließend wird mit einer minimalinvasiven Methode wie Schwanzblutung sorgfältig das mütterliche Blut aus der injizierten Mutter gesammelt. Sammeln Sie etwa 50 Mikroliter Blut. Nach Bestätigung der Hämostase kehren Sie den Damm zurück in den Haus-Käfig.

Lassen Sie das gesammelte Blut 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerinnen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um das Serum vom Gerinnsel zu trennen. Nach der erneuten Zentrifugation der Probe werden die klare obere Serumschicht vorsichtig aufgenommen, ohne das Gerinnsel zu stören.

Lagere das Serum bei 20 Grad Celsius, bis es bereit für die nachgeschaltete Zytokinanalyse ist. Nach der Injektion wiegen Sie die Dams täglich drei Tage lang, um die Reaktion auf Poly-IC-Säure zu überwachen. Am Tag der erwarteten Geburt werden Wurfergebnisse wie Wurfgröße, Lebensfähigkeit des Welpen oder kein Wurf erfasst, um auf eine erfolglose Trächtigkeit hinzuweisen.

Entsorgen Sie umgehend alle verstorbenen Welpen und entsorgen Sie sie gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien. Verwenden Sie ELISA- oder Multiplex-Assays, um entzündliche Zytokine wie IL-6 und TNF-alpha im mütterlichen Serum nach Ausblendung oder Kontrollinjektionen gemäß Herstelleranweisung zu quantifizieren. Nach der Quantifizierung werden die Ergebnisse verwendet, um einen repräsentativen Schwellenwert für die MIA-Antwort festzulegen.

Führen Sie schließlich eine statistische Analyse mit unserer Software durch, um die Beziehung zwischen den Alpha-Spiegeln des maternelen Serums IL-6 und TNF zu bewerten. Nach der Verabreichung von Poly-IC am embryonalen Tag 9,5 zeigten MIA-Dämme signifikant erhöhte IL-6-Spiegel im Vergleich zu Kontrolldämmen. Die TNF-Alpha-Werte zeigten eine starke positive Korrelation mit den IL-6-Spiegeln der Mutter.

Zwischen Embryonaltag 0,5 und Embryonaltag 9,5 nahmen Mutter, die erfolgreich einen Wurf entbunden, deutlich mehr Gewicht zu als Mütter, die keinen Wurf hervorbrachten. Einen Tag nach der Injektion verloren MIA-Damme Gewicht, während mit Kochsalzlösung behandelte Kontroll-Damme zunahmen. Aber am embryonalen Tag 12 zeigten beide Gruppen eine ähnliche Gewichtszunahme.

Das Gewicht vor der Schwangerschaft hatte keinen Einfluss auf die Wirksamkeit des Streus, weder in salzhaltig behandelten Kontroll- noch in vermissten Streu-Dammen. C57 BL6-Mäuse aus Jackson Labs hatten jedoch erfolgreichere Würfe als C57 BL6-Mäuse aus Charles River während des MIA-Verfahrens. Im Gegensatz dazu beeinflusste die Quelle des Poly-IC nicht die Wirksamkeit des Wurfs.

Außerdem hatten Tiere aus Jackson Labs eine robustere mütterliche Entzündungsreaktion, gemessen durch Serum IL-6, im Vergleich zu Tieren aus Charles River. Im Gegensatz dazu war die mütterliche Entzündungsreaktion zwischen verschiedenen Quellen von Poly-IC gleich. Das Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Erzeugung des frühen MIA-Modells und die Korrelation der Schwere der mütterlichen Entzündung mit experimentellen Ergebnissen der Nachkommen. Es ist entscheidend, detaillierte Aufzeichnungen zu führen, die Anzahl der Reagenzien zu verfolgen und die mütterlichen Zytokinreaktionen in allen Dämmen zu bewerten, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.