Einzelzellenisolierung aus koronarem Endarteriektomiegewebe bei Patienten mit koronarem Bypass-Transplantat

Unser Hauptforschungsschwerpunkt liegt darauf, die zelluläre Vielfalt instabiler atherosklerotischer Plaques zu kartieren, um Zell-zu-Zell-Interaktionen zu verstehen und anschließend RNA-basierte prognostische Marker zu entwickeln. Die Membranfragilität behindert die Einzelzell-Isolierung vom während der Endarteriektomie entstandenen Gewebe. Daher beinhaltet dieses Protokoll die Isolierung erhaltener Zellkerne, wodurch transkriptomische Profilierung von Hochrisikoplaques ermöglicht wird.

Um zu beginnen, sammeln Sie alle Reagenzien und die Kühlbox, um das Verfahren durchzuführen. Waschen Sie das Gewebe ein- oder zweimal mit serumfreiem RPMI-Medium, um Blutflecken und -fragmente zu entfernen. Mit steriler Pinzette wird das Gewebe auf eine sterile Petrischale übertragen und das Gewicht erfasst.

Mit einer chirurgischen Klinge Nummer 10 wird das Gewebe in kleine Stücke von etwa einem Kubikmillimeter Durchmesser zerkleinert. Gib jetzt einen Milliliter gekühlten Lysepuffer hinzu und das Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Lösen Sie das Gewebe auf Eis mit einem Mikrostößel, indem Sie eine sanfte, gleichmäßige Kraft anwenden und den Mikrostößel abwechselnd im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn wirbeln.

Setzen Sie die Lyse etwa 30 Minuten fort, während Sie die Probe auf Eis halten. Filtern Sie die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Porensieb in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr, um Ablagerungen und Gewebestücke zu entfernen. Zentrifugiere die Kerne bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor.

Dann entfernen Sie das Überdachungsmittel mit einer normalen Pipettenspitze, ohne das Pellet zu stören. Kühlen Sie die Kernspülung vor der Verwendung in einem Resuspensionspuffer auf Eis. Suspendieren Sie das Pellet erneut in der gekühlten Kerne und dem Puffer der Wiederaufhängung.

Beurteilen Sie schnell die Lysiseffizienz und Zelllebensfähigkeit, indem Sie fünf Mikroliter Trypanblau zu einem Aliquot der Probe hinzufügen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Wenn lebensfähige Zellen unter dem Mikroskop beobachtet werden, wiederholen Sie die Phasen der Lyse, Filtration und Zentrifugation. Anschließend filtert man die Lösung durch ein 30-Mikrometer-Porensieb in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr, um Schmutz und Klumpen zu entfernen.

Zentrifugiere die Kerne bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor. Nach der Zentrifugation wird das Überstandsmittel mit einer normalen Pipettenspitze entfernt, ohne das Pellet zu stören, und das Pellet in einem Milliliter-Nuclei-Wasch- und Resuspensionspuffer wieder suspendiert. Nehmen Sie 15 Mikroliter der isolierten Kernsuspension in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Fügen Sie fünf Mikroliter Trypan-Blau-Farbstoff mit 0,4 % Gewicht pro Volumen zur Kerne hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipetteren. Nach einer fünfminütigen Inkubation werden 10 Mikroliter der gefärbten Mischung auf ein Hämozytometer geladen. Beobachten Sie die Probe unter einem invertierten Mikroskop der Verbindung, um die Morphologie zu untersuchen und die Anzahl der Kerne zu zählen.

Nehmen Sie einen Milliliter der isolierten Kernsuspension und zentrifugieren Sie mit 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor. Entfernen Sie das Überdachungsmittel mit einer normalen Pipettenspitze, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie das Pellet in einen 200 Mikrolitern fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer auf, der aus PBS und 1 % Rinderserumalbumin besteht.

Teilen Sie die 200 Mikroliter resuspendierter Kerne in zwei Aliquoten. Behalte 100 Mikroliter als unverfärbte Kontrolle und verwende die restlichen 100 Mikroliter als gefärbte Probe. Fügen Sie der gefärbten Probe einen Mikroliter-DAPI aus einer Milligramm-pro-Milliliter-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen.

Vorsichtig durch Pipettern mischen und fünf Minuten lang bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubieren. Stellen Sie das Durchflusszytometer so ein, dass es den violetten Laser auf 405 Nanometer verwendet, und detektieren Sie mit 448 mal 45 Nanometern. Führen Sie zuerst die unverfärbte Kontrollprobe durch und erfassen Sie mindestens 10.000 Ereignisse der Gesamtpopulation.

Erstellen Sie ein Diagramm von Vorwärtsstreufläche versus Vorwärtsstreuungshöhe, um Singlets von Doublets und Aggregaten zu unterscheiden. Zeichnen Sie ein Gatter um Ereignisse, die eine lineare Beziehung zeigen, um nur Singlet-Kerne zu erhalten. Als Nächstes erstellen Sie ein bivariates Diagramm der Vorwärtsstreufläche gegenüber der Seitenstreufläche und wenden ein breites Gate an, das die gesamte Streupopulation umfasst.

Erstellen Sie nun ein 2D-Dichte-Pseudo-Farbdiagramm der Seitenstreufläche gegenüber einer violetten 450-Nanometer-Fläche. Verwenden Sie die unverfärbte Kontrolle zur Definition der Hintergrundfluoreszenz und der Platzierung des Führungsgates. Identifizieren und gaten Sie die unterschiedliche DAPI-positive Population, die den intakten Kernen entspricht.

Nehmen Sie 50 Mikroliter Kernsuspension und fügen Sie einen Mikroliter DAPI aus einer von einem Milligramm pro Milliliter Lagerlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Sanft durch Pipetteren mischen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, bevor die konfokale Bildgebung durchgeführt wird. Montiere fünf Mikroliter der gefärbten Kernsuspension auf einen sauberen Glasschlitten und decke ihn mit einem Deckel ab.

Als Nächstes öffnen Sie die Konfokalmikroskop-Software und beobachten Sie die Kerne im 40-fachen Hellfeld. Abschließend werden konfokale Bilder mit dem laserabtastenden konfokalen Mikroskop aufgenommen. Erzeugen Sie DAPI mit einem 405-Nanometer-Laser und sammeln Sie Emissionen zwischen 429 und 474 Nanometern.

Nach der nuklearen Isolierung und der Trypan-Blaufärbung wurde eine deutliche Population von Kernen ohne intakte lebensfähige Zellen beobachtet, was eine effektive Gewebelyse bestätigte. Isolierte Kerne erschienen unter dem Mikroskop als dichte, runde, dunkelblaue Körper, was auf eine erfolgreiche nukleare Isolierung hinweist. Verkalktes Plaquegewebe führte zu einer geringeren Kernausbeute und einer verminderten Kernqualität.

Die Durchflusszytometrie der unverfärbten Kontrolle zeigte 77,88 % Senkeln und 0,19 % DAPI-positive Ereignisse, was die Ausgangs-Autofluoreszenz widerspiegelt. Die DAPI-gefärbte Probe zeigte 68,1 % Senkeln und 25,31 % positive DAPI-Kerne, was auf eine deutliche Fluoreszenzverschiebung hindeutet. Die Histogrammanalyse zeigte eine nach rechts gerichtete Fluoreszenzverschiebung der DAPI-gefärbten Kerne im Vergleich zur ungefärbten Kernpopulation.

Konfokale Bildgebung der gefärbten Probe zeigte leuchtend blaue fluoreszierende Zellkerne, die intakt und gleichmäßig markiert waren. Die RNA-Sequenzierungsanalyse von Einzelkernen identifizierte 16 verschiedene Zellcluster nach Dimensionsreduktion. Die größte Herausforderung bei der Durchführung dieses Protokolls ist die hohe Verkalkung dieses Gewebes, was die Qualität und den Ertrag der Kerne kritisch beeinträchtigt.

Das Gesichtstranskriptom ist ein weiterer Ansatz, den wir nutzen können, um detaillierte Informationen zu erhalten, sodass es uns Informationen über spezielle Genexpression sowie Zell-zu-Zell-Interaktion liefert.