Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Die aktuelle 2D-Bildgebung verfehlt die vollständige Morphologie der stellaten Zellen, was strukturelle und funktionelle Einblicke einschränkt. Dieses Protokoll ermöglicht robuste Erfassungen komplexer 3D-Architekturen.

Zu Beginn kneifen Sie die Handflächen einer betäubten Maus, um eine richtige Betäubung zu gewährleisten. Besprühe den Bauch mit 70 % Ethanol, um das Fell zu befeuchten. Mit einer Pinzette heben Sie die Haut in der Mitte des Bauches in Ausrichtung der Hinterbeine auf und beginnen Sie mit dem Schneiden der Haut, um den Bauch freizulegen.

Dann verwenden Sie mit PBS benetzte Wattestäbchen, um Därme und andere Organe zur Seite zu bewegen und den linken Lappen anzuheben. Schneiden Sie vorsichtig die Membran zwischen linkem Lappen und Caudatus durch. Dann verwenden Sie eine Naht, um an der oberen Basis des linken Lappens zu binden.

Schneiden Sie den linken Lappen unterhalb des Nahtknotens ab und legen Sie ihn zur Entnahme und Verarbeitung einer Gewebeprobe beiseite. Verwenden Sie PBS-befeuchtete Wattestäbchen, um die Leber zu bewegen und die Pfortvene freizulegen. Dann führen Sie die Katheternadel vorsichtig etwa auf halber Länge in die Pfortvene ein.

Entfernen Sie die Katheternadel. Stellen Sie einen Rückfluss des Blutes durch den Katheter sicher, um eine erfolgreiche Einführung anzuzeigen. Verbinden Sie den gefüllten Schlauch von der laufenden Perfusionspumpe mit dem Katheter und perfundieren Sie die Leber mit 20 Millilitern PBS.

Klemmen Sie die Lungenarterie oberhalb der Leber mit einem Hämostat ab, um zu verhindern, dass das PBS durch das Herz gelangt. Schneide die untere Vena cava durch, um den Druckaufbau abzubauen. Stelle die Pumpengeschwindigkeit auf fünf Milliliter pro Minute ein.

Nach 15 Minuten stoppen Sie die Pumpe, um das Reservoir auf 4 % Paraformaldehyd zu ersetzen, und perfundieren Sie die Leber mit 25 Millilitern 4 % Paraformaldehyd. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Leber aus den umliegenden Organen, indem Sie die verbindenden Gewebe durchtrennen. Legen Sie die Leber in ein 50-Milliliter-konisches Rohr, das mit 25 Millilitern 4%-Paraformaldehyd gefüllt ist.

Stellen Sie das Rohr über Nacht horizontal auf eine Schaukelplattform in einem kalten Raum mit vier Grad Celsius bei 1,5 Umdrehungen pro Minute auf. Am nächsten Tag wird die Leber dreimal in PBS auf einer Schaukelplattform für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 1,5 Umdrehungen pro Minute gewaschen. Übertragen Sie die Leber auf 20 Milliliter PBS mit 0,02 % Natriumazid und lagern Sie bei vier Grad Celsius.

Schneiden Sie die Leberproben in Stücke von etwa 0,5 bis 1 Kubikzentimeter Größe. Übertragen Sie die Leberproben in Glasphiolen mit Schraubverschluss. Dehydrieren Sie die Proben in einer wasserverdünnten Methanolserie von 20 % bis 80 % auf einem Radrotator mit acht Umdrehungen pro Minute für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur.

Nach der Probenbleichung, Permeabilisierung, Immunkennzeichnung und Klärung wird die Probe über Nacht bei Raumtemperatur in Dibenzyläther inkubiert, bevor sie bildgeblich gemacht wird. Proben können bis zu einem Jahr in Dibenzyläther gelagert werden, ohne dass das Färbungssignal verloren geht. Für die konfokale Bildgebung werden die klarisierte Probe in eine 35-Millimeter-Glasbodenschale mit Glasboden der Nummer 1,5 gelegt.

Füllen Sie die Schale mit Ethyl-Cinnamat und tauchen Sie die Probe vollständig ein. Dann stellen Sie die Schale auf die Bühne des Konfokalmikroskops. Nehmen Sie ein Kachelbild auf der hellsten Ebene auf, um einen großen Bereich der Probe mit dem Format 1024 mal 1024 und einer Geschwindigkeit von 600 zu erfassen.

Wählen Sie basierend auf dem Kachelbild interessante Bereiche aus, um einen Z-Scan mit höherer Auflösung zu erstellen. Als Nächstes wird ein Z-Stack erschaffen, der die gesamte Tiefe des freigegebenen Gewebes mit der höchsten vom Mikroskop unterstützten Auflösung in einem 1024 mal 1024 Format und einer Scangeschwindigkeit von 600 abdeckt. Die erfolgreiche Durchsetzung und Fixierung der Mausleber führte zu einer einheitlichen, blassen, beigegelben Farbe.

Eine unsachgemäße Perfusion führte zu dunkelroten oder braunen Bereichen der Blutgerinnsel, was die optische Klarheit verringerte und zu einem hohen Hintergrundsignal in diesen Bereichen führte. Vollständige optische Transparenz wurde nach der Inkubation im Dibenzyläther erreicht, wo das Gewebe im Vergleich zum Vorher klar erschien. Hochauflösende Z-Stacks zeigten feine dendritische Prozesse, die vom Zellkörper einzelner hepatischer Sternzellen ausgehen.

Sowohl Kontroll- als auch chronische Kohlenstofftetrachlorid-Leberproben zeigten starke und stabile fluoreszierende Signale unter konfokaler Mikroskopie. Diese Pipeline kartiert stellate Zellmorphologie im komplexen Server der Mikroumgebung reproduzierbar und erfasst dendritische Prozesse sowie räumliche Beziehungen zu benachbarten Zellen. Zeitaufwand ist ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung des Protokolls.

Der Clearing-Prozess dauert etwa drei Wochen, was eine vorausschauende Planung erfordert. Durch die präzise 3D-morphometrische Analyse verknüpft diese Plattform die Struktur der Fibroblasten mit Funktionen und fördert so Einblicke in die Gewebehomöostase und einen Z-Mechanismus.