Name: Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:53:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Pankreasinseln aus Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode liefert hochreine, lebensfähige Inseln für Diabetesforschung und Transplantationsstudien.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>21 G x 2 Zoll. BD PrecisionGlide-Nadel</td><td>BD</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>500 & Mikro; m Messingrahmen und 304 Edelstahl-Siebe, 3" Durchmesser x 1" tief (Siebnummer 35)</td><td>McMaster-Carr</td><td>34735K525</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite sterile Spritzen, Luer-Lock.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-178</td><td></td></tr><tr><td>Biogel PI UltraTouch M</td><td>M&ouml; lnlycke</td><td>42665</td><td></td></tr><tr><td>Bonner Schere; Gerade; scharfe Spitzen; 15 mm Klingenlänge; 3 1/2" Gesamtlänge</td><td>Roboz</td><td>RS-5840</td><td></td></tr><tr><td>Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9956482</td><td></td></tr><tr><td>Cell-IQ Serie 5,8 cu.ft. CO2-Laborinkubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Kern 100 mm Nicht TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Corning Fetal Bovine Serum, 500 ml, regulär, USDA-Sicherheitstest (hitzeinaktiviert)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning Islet-Gradient 1,069 (Dichte 1,069 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-815-CIS</td><td>Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma</td></tr><tr><td>Corning Islet Gradient 1,096 (Dichte 1,096 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-691-CIS</td><td>Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma</td></tr><tr><td>Corning Islet-Gradient 1,108 (Dichte 1,108 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-692-CIS</td><td>Erfordert eine Sonderanfrage von der Firma</td></tr><tr><td>Covidien Tendersorb Unterpolster</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-225-102</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Grade II</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 50 mL hochklare, konische Zentrifugenröhren</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Aluminiumfolie, Normal-Gauge-Rolle</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Nicht gewebte Mullschwämme</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-559</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand wiederverwendbare Glas-Schwerlastbecher mit niedriger Form</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101600</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mirkoskop&nbsp; BZ-X810</td><td>Schlüssel</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Glukoselösung</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Mikronadelhalter</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, Kalzium, Magnesium, kein rotes Phenol</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hämostatische Zange Klassische Crile 5-1/2 Zoll Länge</td><td>McKesson</td><td>1231217</td><td></td></tr><tr><td>Hudson (Ewald) Zange</td><td>Roboz</td><td>RS-5238</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermische Nadelmonojekt mit 1-1/2 Zoll Länge 16 Gauge Normalwand ohne Sicherung</td><td>McKesson</td><td>43481</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liberase T-Flex, Forschungsqualität</td><td>Roche</td><td>5989132001</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Zytotoxizitätskit, für Säugetierzellen</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; L3224</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB-Softwarepaket</td><td>MathWorks</td><td><a href="https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML">https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML</a></td><td></td></tr><tr><td>NE-4000 Zweikanal-Programmierbare Spritzenpumpe</td><td>Spritzenpumpe</td><td>NE-4000-US</td><td></td></tr><tr><td>NADEL, HYPO STR DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINNE</td><td>McKesson</td><td>408877</td><td></td></tr><tr><td>Nunc-Zellkultur/Petrischalen</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CKX41 Invertiertphasenkontrastmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin' Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, keine Glukose</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM Lager)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST 16R</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-304-Spritzennadel</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z117013-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CHIRURGISCHES VORHANG, WEGWEG, 36 IN X 100 YD</td><td>Covetrus</td><td>10408</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere – ToughCut</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Daumenbinde 4,5" gezackte empfindliche 1,3 mm Spitzenbreite</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Thermowissenschaftliches Nunc 200mL Zentrifugenrohr</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>14-962-17</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Zentrifugenflaschenadapter und Polster</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>12-565-283B</td><td></td></tr><tr><td>TSDUB15 15L Dubnoff Schüttelwasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>300610298</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 4 x 400 mL Schwing-Schaufel-Rotor</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>75003181</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL</td><td>Tygon</td><td>AAXoooo3</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA-Kit</td><td>Kristallchemie</td><td>90060</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und reinigung von pankreasinseln bei lewis-ratten mittels enzymatischer verdauung und dichtegradiententrennung

Pancreatic Islet Isolation and Purification from Lewis Rats Using Enzymatic Digestion and Density-Gradient Separation

Die folgenden Ergebnisse stellen eine typische Inselisolation dar, die mit der beschriebenen Methode durchgeführt wird, wobei zwölf Lewis-Ratten-Pankreasen parallel verarbeitet werden.
Ertrags- und Größenverteilung
Manuelles Aliquot-Zählen und IEQ-Umrechnung
Aus der gemischten Inselsuspension wurden zwei unabhängige 100-μL-Aliquoten gewonnen, wie im Abschnitt "Inselzählung", Schritt 6.1, beschrieben und mit Durchmesser-Bins (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm) beschrieben. Die Zählungen wurden in Inseläquivalente (IEQ; 150 μm Referenz) mit Standardäquivalenztabellen umgerechnet und auf das gesamte Aufhängungsvolumen extrapoliert (siehe Abbildung 4A). Über die Testisolation hinweg (n = 12) betrug die Ausbeute 3330 IEQ/Bauchspeicheldrüse mit einem mittleren Inseldurchmesser im 50–100 μm großen Bin. Repliziere Aliquots mit 18,8 % pro Bin (Variationskoeffizient), was auf moderate Variation hinweist, die mit manuellen Zählmethoden zu erwarten ist. In den vorherigen 14 Inselisolationen ergab diese Methode durchschnittlich 1353 (SD 607) IEQ/Pankreas.
Automatisierte Ganzplattenquantifizierung
Um manuelle IEQ zu benchmarken, wurden Hellfeldbilder bei D1 mit einem Mikroskop aufgenommen und zusammengestickt, um Ganzschüssel-Verbundbilder zu erzeugen (4× Objektiv; 1/100 s Belichtung). Automatisierte Größenmessung und Objektquantifizierung wurden mit Fiji und Codierung mit einer vordefinierten Größenschwelle von 50–600 μm durchgeführt. Die Bilder wurden zunächst vorverarbeitet, um Hintergrundvariationen zu reduzieren und die Kontrastgleichmäßigkeit zu verbessern. Inselstrukturen wurden anhand von Intensitätsunterschieden im Vergleich zum umgebenden Gewebe identifiziert, wodurch binäre Objektmasken erzeugt wurden. Benachbarte oder teilweise berührende Inselchen wurden getrennt, um eine Unterschätzung der Objektanzahl zu vermeiden. Objekte außerhalb des angegebenen Größenbereichs wurden ausgeschlossen, um Trümmer und Nicht-Inselgewebe zu entfernen. Für jedes erhaltene Objekt wurden morphometrische Parameter einschließlich Fläche sowie x- und y-Achsendurchmesser extrahiert. Die Inselchen wurden dann nach Durchmesser gekartet, und der IEQ wurde berechnet, indem die Anzahl der Inselchen in jedem Größenbehälter mit dem entsprechenden Umrechnungsfaktor multipliziert wurde. Die automatisierte Bemessung ergab insgesamt 98.832 Objekte mit mittleren x- und y-Achsendurchmessern von 117 μm bzw. 116 μm sowie einem geschätzten Gesamtwert von 16.350 IEQ, was stark mit manuellem IEQ bei D0 korrelierte (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; siehe Abbildung 4A-C).
Inselzell-Shedding
Ganzplattenbilder wurden 2 Stunden nach der Reinigung und erneut am ersten Tag (D1) aufgenommen, wobei dieselbe Methodik in der "Automatisierten Ganzplattenquantifizierung" verwendet wurde, um die frühe Inselstabilisierung ("Shedding") zu bewerten. Die Objektanzahl änderte sich um 0,9 % und IEQ um -6,11 % von 2 Stunden auf D1 (siehe Abbildung 4D). Der gepaarte Vergleich der Inseldurchmesser zwischen D0 und D1 zeigte eine statistisch signifikante Medianabnahme von 2 μm (Wilcoxon-Signed-Rank-Test, p = 0,0136, n = 2820). Allerdings ist das geringe Ausmaß dieser Veränderung vermutlich weder biologisch noch klinisch bedeutsam.
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig4.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: Quantitative Bewertung der Inselgrößenverteilung, der Korrelation und des frühen Haarausfalls. Grafische Zusammenfassung der Inselmessungen, die durch manuelle und automatisierte Analysen gewonnen wurden. (A) Tag 0 (D0) Inselgrößenverteilung basierend auf manueller Quantifizierung über standardisierte, inseläquivalente IEQ-Behälter. (B) Tag 1 (D1) Inselgrößenverteilung, bestimmt durch automatisierte, bildbasierte Messungen über dieselben standardisierten IEQ-Größenbehälter. (C) Korrelation der Zählungen zwischen manueller D0- und automatisierter D1-Quantifizierung über IEQ-Größen-Bins. (D) Box-Diagramm der Verteilung der Inseldurchmesser zwischen D0 und D1 für automatisierte Messungen derselben Platte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Reinheit (endokrin vs. exokriner Inhalt)
Dithizon (DTZ) Färbung
Auf D1 wurde ein Aliquot von Inselchen (n = 451) bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang mit DTZ gefärbt und sofort mit Hellfeldmikroskopie (4× Objektiv; 1/20 s Belichtung) abbildet. In Fidschi wurden Hintergrundpixel entfernt, sodass die verbleibende Pixelfläche der gesamten Inselfläche entsprach. DTZ-negative exokrine Geweberegionen, die durch dunkleren Farbkontrast identifiziert wurden, wurden manuell mit einem Lasso-Werkzeug ausgewählt, und die Fläche jeder interessanten Region wurde automatisch in Pixeln erfasst. Die endokrine Reinheit wurde als Prozentsatz der DTZ-positiven Pixel im Verhältnis zu den Gesamtpixeln der Inseln berechnet, was eine Reinheit von 98,56 ± 0,38 % ergibt (Abbildung 5A).
Tragfähigkeit und funktionale Leistung
Glukosestimulierte Insulinsekretion (GSIS)
Zu jedem Zeitpunkt (D1, D3, D7) wurden 15 größengleiche Inselchen handverlesen, die in einzelne Brunnen einer 24-Brunnen-Platte platziert wurden, die vierfach vorbereitet wurden. Die Inselchen wurden bei 37 °C 5 % CO2im Krebspuffer unter einem niedrig-hoch-niedrigen Glukosestimulationsprotokoll inkubiert: zuerst bei niedriger Glukose (2,8 mM, 60 min), gefolgt von hoher Glukose (16,7 mM, 60 min, siehe Tabelle 1). Am Ende jeder Inkubationsphase wurden Abflussfraktionen gesammelt, und die Insulinkonzentrationen wurden mittels eines Ratteninsulin-ELISA-Tests quantifiziert. Die Stimulationsindizes wurden als Verhältnis der Insulinsekretion unter hohen zu niedrigen Glukosebedingungen berechnet. Die Stimulationsindizes lagen an den Tagen 1, 3 und 7 bei 9,37, 8,34 und 6,7, ohne signifikante Unterschiede (Abbildung 5B).
Lebende/Tote Flecken
Bei D1, D3 und D7 wurden 15 Inselchen handverlesenen und mit dem Live/Dead-Viability-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers befleckt. Kurz wurden die Inselchen 30 Minuten lang in der Live/Dead-Färbungslösung bei 25 °C inkubiert und anschließend unter konsistenten Mikroskopeinstellungen fotografiert, um die Vergleichbarkeit über Zeitpunkte zu gewährleisten (4X-Objektiv; 1/30 s Belichtung, Texas Red- und GFP-Filter). Die Viabilität wurde mit einem Python-Skript quantifiziert, das Scikit-Image für die Inselsegmentierung und Fluoreszenzmessung verwendete. Die Inselchen wurden identifiziert, indem die grünen und roten Fluoreszenzkanäle kombiniert wurden, Li's Schwellenmethode zur Erzeugung einer binären Maske verwendet und Einzugsgebiete segmentiert wurden, um berührende Inselchen zu trennen. Objekte wurden nach Gebiet gefiltert, um Trümmer und Artefakte auszuschließen. Für jedes Inselchen wurde die Viabilität als Prozentsatz der lebenden integrierten Dichte (grüne Pixel) relativ zur gesamten integrierten Dichte (grün plus rote Pixel) berechnet. Die Ergebnisse zeigten eine Lebensfähigkeit von 68 ± 9 % bei D1, 98,2 ± 0,6 % bei D3 und 100 % bei D7. Eine positive Kontrollprobe, die 10 Minuten mit 70 % Ethanol behandelt wurde, zeigte eine Viabilität von 2,7 ± 7,2 % (siehe Abbildung 5C-F).
<img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig5.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 5"> 
Abbildung 5: Bewertung der Reinheit, Lebensfähigkeit und funktionellen Reaktionsfähigkeit der Inselchen. Repräsentative Bilder und quantitative Zusammenfassungen isolierter Inselmerkmale im Zeitverlauf. (A) Repräsentatives 10× Hellfeldbild von mit Dithizon (DTZ) gefärbten Inselchen, die rot gefärbte endokrine Inselchen und ungefärbtes exokrines Gewebe zeigt. (B) Glukosestimulierte Insulinsekretionswerte (GSIS) mit hohem Glukose/niedriger Glukose (HG/LG) Stimulationsindex für die Tage 1, 3 und 7. (C-E) Lebendige/tote Fluoreszenzbilder von Inselchen am Tag 1 (C), Tag 3 (D) und Tag 7 (E). (F) Live/Dead Fluoreszenzbild von positiv-kontrollierten Inseln, behandelt mit Ethanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(A) Waschmedium</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Abschließende Schwerpunkte</td>
			<td>Menge (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetales Rinderserum</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Streptokokken (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>12,5 mL aus 1M-Serien.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>5 mL aus 200 mM Serien.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Insel-Kulturmedien</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Abschließende Schwerpunkte</td>
			<td>Menge (mL oder g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, keine Glukose</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetales Rinderserum</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Streptokokken (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>11 ml aus 1M-Serien.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natriumpyruvat</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5,5 mL aus 100-mM-Serien.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose</td>
			<td>5,5 mM</td>
			<td>2,75 mL aus 200 g/L-Lager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Penicillin-Streptomycin-Spüllösung</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Abschließende Schwerpunkte</td>
			<td>Menge (mL oder g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kochsalzlösung, 0,9 %</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td>
			<td>2%</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(D) Abschreckpuffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Abschließende Schwerpunkte</td>
			<td>Menge (mL oder g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetales Rinderserum</td>
			<td>20%</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E) Krebspuffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Abschließende Schwerpunkte</td>
			<td>Menge (mL oder g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>975 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>115 mM</td>
			<td>6,72 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>24 mM</td>
			<td>2,02 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,3728 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,0952 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,2775 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Lösungsliste. Zusammensetzungs- und Vorbereitungsdetails für alle im gesamten Isolierungs- und Reinigungsprotokoll verwendeten Lösungen. Jeder Unterabschnitt listet Komponenten, Endkonzentrationen, Vorbereitungsvolumina und Katalognummern auf. (A) Waschmedium, das zum Abspülen und Waschen von Tüchern während der Verdauung und Reinigung verwendet wird. (B) Islet Culture Media, verwendet für die Pflege und Lebensfähigkeit von Inselchen nach der Isolation. (C) Penicillin-Streptomycin-Spüllösung, verwendet zur Sterilisation und Spülung entnommener Bauchspeicheldrüsen. (D) Quenching Buffer, verwendet zur Beendigung der enzymatischen Verdauung und zur Erhaltung der Zelllebensfähigkeit. (E) Krebspuffer, verwendet bei glukosestimulierten Insulinsekretionstests (GSIS).
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anzahl der Bauchspeicheldrüsen</td>
			<td>Kollagenase (15,38 mg/mL)</td>
			<td>Thermolysin (1 mg/mL)</td>
			<td>DNAse (100 mg/mL)</td>
			<td>Arbeitspuffer</td>
			<td>600-mL-Becher zur Nutzung</td>
			<td>Lautstärke/Becher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>4,5 mL</td>
			<td>2,25 mL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>450 mL</td>
			<td>5</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>3,6 mL</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>360 μL</td>
			<td>360 mL</td>
			<td>4</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>300 mL</td>
			<td>3</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>2,4 mL</td>
			<td>1,2 mL</td>
			<td>240 μL</td>
			<td>240 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>0,9 mL</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>180 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,75 mL</td>
			<td>150 μL</td>
			<td>150 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abschließende Schlussfolgerung.</td>
			<td>0,15 mg/mL</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Verdauungsenzymlösung nach Bauchspeicheldrüsenmenge. Volumina von Kollagenase, Thermolysin und DNase I erforderlich, um das Working Dissociation Medium (WDM) für unterschiedliche Mengen an Rattenpankreasen vorzubereiten. Die endgültigen Konzentrationen jedes Enzyms sind am unteren Rand der Tabelle aufgeführt.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anzahl der Bauchspeicheldrüsen</td>
			<td>Nummer 50 mL Röhren</td>
			<td>Volumen/Spritze</td>
			<td>Anzahl von 1.096 Spritzen</td>
			<td>Anzahl von 1.068 Spritzen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>10 Röhren</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>8 Röhren</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>6 Röhren</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>4 Röhren</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>4 Röhren</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>2 Röhren</td>
			<td>20 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 3: Gradientenbelastung nach Bauchspeicheldrüsenmenge. Anzahl der 50-mL konischen Röhren und entsprechende Gradientenvolumen, die für die Inselreinigung benötigt werden, basierend auf der Anzahl der verarbeiteten Bauchspeicheldrüsen.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inseldurchmesserbereich (μm)</td>
			<td>Inselpartikelzahl (KI)</td>
			<td>IEQ-Umwandlungsfaktor</td>
			<td>IEQ pro Bereich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-100</td>
			<td>a</td>
			<td>* 0.167</td>
			<td>a * 0,167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>b</td>
			<td>* 0.648</td>
			<td>b * 0,648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-200</td>
			<td>c</td>
			<td>* 1.685</td>
			<td>c * 1,685</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201-250</td>
			<td>d</td>
			<td>* 3.500</td>
			<td>d * 3,500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>251-300</td>
			<td>e</td>
			<td>* 6.315</td>
			<td>e * 6,315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-350</td>
			<td>f</td>
			<td>* 10.352</td>
			<td>f * 10,352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 350</td>
			<td>g</td>
			<td>* 15.833</td>
			<td>g * 15,833</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 4: Umwandlung der Inseläquivalenz. Umwandlung der Inseldurchmesserbereiche in standardisierte Inseläquivalente (IEQ). Die Tabelle listet die beobachteten Inseldurchmesser-Bins, die Anzahl der Inselpartikel pro Bereich, den entsprechenden IEQ-Umrechnungsfaktor für jede Größenzone und den resultierenden IEQ-Beitrag pro Bereich auf.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Pancreatic islets are essential for both clinical islet transplantation and preclinical studies aimed at understanding the mechanisms and progression of ...

pancreatic-islet-isolation-purification-from-lewis-rats-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Wir beschreiben ein Protokoll hier für intakte Inseln von neugeborenen Mäusen zu isolieren. Bauchspeicheldrüsen wurden teilweise mit Kollagenase, gefolgt von Waschen und Hand picking verdaut. 20-80 islet Cluster können pro Bauchspeicheldrüse von neugeborenen Mäusen erhalten werden, die für mehrere islet Studien geeignet sind.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Erfahren Sie die Isolierung von Pankreasinseln aus Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode liefert hochreine, lebensfähige Inseln für Diabetesforschung und Transplantationsstudien.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

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