Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung
3. April 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung eines standardisierten Hochdurchsatz-Lewis-Ratten-Augenisolierungs-Protokolls, um Austragung, Reinheit, Lebensfähigkeit und funktionelle Lebensdauer zu optimieren. Bestehende Methoden führen zu variablen, unreinen, kurzlebigen Ösen. Dieses Protokoll standardisiert Verdauung, Reinigung und Pooling, um Konsistenz und Langlebigkeit zu verbessern.
Zu Beginn legen Sie eine eingeschläferte Ratte unter ein Mikroskop. Mit einer Hautschere machen Sie einen V-förmigen Schnitt, beginnend von der Schamsynthese bis zu jedem seitlichen Rippenkäfig, um an die Bauchhöhle zu gelangen. Mit einer flachen Zange ziehen Sie den Dünn- und Dickdarm auf die linke Seite des Tieres zurück, um den Bereich der Bauchhöhle zu befreien.
Dann verwenden Sie die flache Pinzette und gebogene Hämostaten, um den oberen Duodenum zu entfalten. Stellen Sie sicher, dass der gemeinsame Gallengang und die hepatische Pfortader im Sichtfeld sind. Verwenden Sie nun die gebogenen Hämostaten, um die Leber in Richtung des Cephalons zurückzuziehen.
Klemmen Sie den gemeinsamen Gallengang und die Lebervene ein bis zwei Millimeter von der Leber ab. Unter dem Mikroskop, mit flacher Pinzette und flachen Hämostaten, wird der Inhalt im Duodenum sanft mobilisiert, um den Schließmuskel von Audi zu reinigen. Dann klemmen Sie den Duodenum vorsichtig etwa fünf Millimeter von jeder Seite des Audi-Schließmuskels ab, um die umliegende Region zu isolieren.
Sorgen Sie für minimale Kompression, um die Gewebeintegrität zu erhalten. Führen Sie vorsichtig die Nadel einer Spritze mit sterilem WDM durch die Duodenalwand ein. Führen Sie die Nadel durch den Schließmuskelkörper und führen Sie sie in den Hauptgang der Bauchspeicheldrüse zur Durchströmung.
Bei konstantem Druck werden sieben bis zehn Milliliter WDM mit einer Rate von etwa 500 Mikrolitern pro Sekunde in die Bauchspeicheldrüse eingepumpt, bis die Bauchspeicheldrüse vollständig aufgebläht ist. Entferne jetzt beide flachen Hämostate aus dem Duodenum. Anschließend wird die Bauchspeicheldrüse vorsichtig von den umliegenden Strukturen befreit, beginnend mit Milz, Magen, Dickdarm, Zwölffingerdarm und Mesentär.
Heben Sie die perfundierte Bauchspeicheldrüse vorsichtig mit einer flachen Zange an und verwenden Sie eine feine Sezierschere, um alle verbliebenen Bindegewebsbefestigungen abzutrennen. Übertragen Sie die entfernte Bauchspeicheldrüse sofort in eine Petrischale mit eiskalter Spüllösung und entnehmen Sie die nächste Bauchspeicheldrüse, während die entfernte Bauchspeicheldrüse gereinigt wird. Zur Reinigung der Bauchspeicheldrüse verwenden Sie eine fein gebogene Pinzette und eine feine Sezierschere, um vorsichtig Lymphknoten, Fettgewebe, Mesentarie und große Gefäße aus der perfundierten Bauchspeicheldrüse zu entfernen, falls vorhanden.
Übertragen Sie die gereinigte Bauchspeicheldrüse in einen sterilen 600-Milliliter-Becher mit 25 Millilitern kaltem WDM. Decken Sie den Becher mit steriler Alufolie ab, um die Sauberkeit während des Übergangs vom chirurgischen Arbeitsbereich zum Zellkulturbereich zu gewährleisten. Bringen Sie den Becher in ein Orbitalshaker-Wasserbad, das für 10 Minuten auf 130 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.
Nach fünf Minuten wirbeln Sie den Becher manuell im Uhrzeigersinn und dann gegen den Uhrzeigersinn, um die Gewebedissoziation zu unterstützen. Nach 10 Minuten wird das Becherglas schnell umgesetzt und in Eis getaucht, um die Enzymaktivität zu verlangsamen. Dann gibt man der Lösung im Becher ein gleiches Volumen Abschreckpuffer, um die Verdauung zu stoppen.
Mit einer 50-Milliliter-Spritze, die mit einer 14-Gauge-Spinalnadel versehen ist, wird die Gewebesuspension sanft wiederholt abgesaugt und ausgestoßen, um große Gewebefragmente zu dissoziieren. Übertragen Sie die Federung in 200-Milliliter-konische Röhren. Nach dem Zentrifugieren der Suspension wird das Übersetzungsmittel vorsichtig dekantiert und das Pellet in 100 Millilitern Waschmedium wieder suspendiert.
Filtern Sie nun die Suspension durch ein steriles 500-Mikrometer-Sieb, das über einem sterilen 600-Milliliter-Becher gelegt wird, um großes unverdautes Gewebe zu entfernen. Transferieren Sie das Filtrat in neue 200-Milliliter-Kegelröhren, bevor Sie erneut zentrifugieren. Für die Ösenreinigung verwenden Sie eine vorverheiratete 10-Milliliter-serologische Pipette, um jedes Gewebepellet in 15 Millilitern Gradientlösung pro zwei Milliliter Pelletvolumen neu zu suspendieren.
Sanft rühren, bis die Suspension gleichmäßig ist. Geben Sie vorsichtig 15 Milliliter der Zellsuspension in den Boden jedes 50-Milliliter-konischen Rohrs und vermeiden Sie den Kontakt mit den Rohrwänden, um saubere Gradienten zu gewährleisten. Dann verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um 10 Milliliter pro Gradient mit einer Menge von fünf Millilitern pro Minute abzugeben, während die 16-Gauge-Nadelspitze an der Innenwand des Rohrs positioniert wird, um das Mischen zu verhindern.
Nach der Zentrifugation der Röhren identifizieren Sie die Ösenschicht, die sich an den Schnittstellen zwischen den Gradientenschichten befindet. Mit einer verwöhnten Past-Pipette sammeln Sie die Ösenschicht und übertragen die gesammelten Ösen in ein vorgekühltes 200-Milliliter-konisches Rohr mit fünf Millilitern Waschmedium. Erhöhen Sie das Volumen mit Waschmedium auf 200 Milliliter und führen Sie die folgenden Wasch- und Zentrifugationsschritte durch.
Anschließend werden die Ösen gleichmäßig in 100-Millimeter-Nicht-Gewebekultur-Petrischalen angerichtet, wobei für jeweils fünf verarbeitete Bauchspeicheldrüsen eine Platte verwendet wird. Während der Testisolation betrug die Ausbeute 3.330 Ösenäquivalente pro Bauchspeicheldrüse mit einem mittleren Ösendurchmesser im 50- bis 100-Mikrometer-Behälter. Die automatisierte Größe ergab insgesamt 98.832 Objekte, was stark mit manuellen Lidäquivalenten am Tag null korrelierte.
Die endokrine Reinheit lag am ersten Tag bei etwa 98,56 %, basierend auf Dithozon-Färbung. Die Stimulationsindizes lagen am ersten Tag bei 9,37, 8,34 am dritten Tag und 6,7 am siebten Tag, ohne signifikante Unterschiede zwischen den Zeitpunkten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ösentransplantation, Betazellfunktion, Diabetes-Umwandlung, Ösenkapselung und Interaktionen mit Ösen-Immun- oder Mikroumgebungs-Interaktionen.
Dieses Protokoll kann auf präklinische Transplantationen, Diabetesmodellierung, Kapselungsstudien und in-vitro-funktionelle Assays anwendbar sein, die hohe Reinheit von Lewis-Ratten-Ösen erfordern.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes, hochdurchsatzfähiges Protokoll zur Isolierung von Pankreasinseln aus Lewis-Ratten, das darauf ausgelegt ist, Ausbeute, Reinheit, Vitalität und funktionelle Langlebigkeit zu maximieren. Die Methode kombiniert chirurgische Gewinnung, enzymatische Verdauung und Reinigung mittels Dichtegradienten und ermöglicht die effiziente Herstellung von hochwertigen Inseln, die sowohl für präklinische Diabetesforschung als auch für Transplantationsstudien geeignet sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Inselbiologie
- Diabetesforschung
- Transplantationswissenschaft
- Zellisolationstechniken
Hintergrund
- Pankreasinseln sind entscheidend für die Diabetesforschung und -transplantation.
- Bestehende Isolationsmethoden liefern oft variable, unreine und kurzlebige Inseln.
- Neuartige Therapien erfordern größere, reinere und standardisiertere Inselpräparationen.
- Eine Standardisierung ist notwendig, um die Reproduzierbarkeit und funktionelle Ergebnisse zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines reproduzierbaren, hochdurchsatzfähigen Protokolls zur Isolierung hochreiner, lebensfähiger Pankreas-Inseln aus Lewis-Ratten.
- Optimierung der Ausbeute und funktionellen Langlebigkeit von Inseln für Forschung und Transplantation.
- Minimierung des manuellen Umgangs und der Variabilität bei der Inselpräparation.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Exposition und Perfusion der Bauchspeicheldrüse über den Ductus pancreaticus principalis mittels steriler Pufferlösung.
- Enzymatische Verdauung in einem Rüttelwasserbad mit Rotation, gefolgt von einer Hemmung der Verdauung und mechanischer Dissoziation.
- Filtration und Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung der Inseln.
- Quantifizierung mittels manueller, auf Aliquots basierender Zählung sowie halbautomatisierter Bildgebung der gesamten Präparation.
- Beurteilung der Reinheit durch Dithizon-Färbung und der Vitalität/Funktion mittels Insulinsekretionsassays unter Glukosestimulation.
Hauptergebnisse
- Die manuelle Zählung ergab etwa 3.300 Inseläquivalente (IEQ) und 2.700 absolute Inseln pro Pankreas (~39.600 gesamt IEQ aus 12 Pankreasorganen).
- Die automatisierte Analyse meldete insgesamt 16.350 IEQ (1.362 IEQ/Pankreas), was die Variabilität der Quantifizierung verdeutlicht.
- Größenverteilung der Inseln: 62 % (50–100 μm), 17 % (100–150 μm), 10 % (150–200 μm), 5 % (200–250 μm), 6 % (>250 μm).
- Die Reinheit betrug etwa 98 % nach Dithizonfärbung; die Vitalität blieb an den Tagen 3 und 7 in vitro bei 98 %.
- Die funktionelle Beurteilung zeigte eine 9- bis 10-fache Steigerung der Insulinsekretion nach Glukosestimulation, die über 7 Tage aufrechterhalten wurde.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Isolierung von hochreinen, lebensfähigen und funktionell robusten Inseln aus Lewis-Ratten.
- Die Inseln eignen sich bis zu sieben Tage nach der Isolierung für In-vitro-Assays und In-vivo-Transplantationen.
- Die Methode unterstützt großangelegte Studien in der Diabetesmodellierung, Transplantation, Kapselung und Inselbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte, hochdurchsatzfähige Isolierung von Pankreasinseln aus Lewis-Ratten löst einen kritischen Engpass in der Diabetesforschung und präklinischen Transplantationsstudien. Dieses Protokoll liefert reproduzierbare, hochreine und funktionell robuste Inselpräparationen und unterstützt skalierbare in-vitro- und in-vivo-Arbeitsabläufe. Eine zuverlässige Versorgung mit Inseln erhöht die Vorhersagegenauigkeit und ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung in frühen Entdeckungs- und translationsmedizinischen Forschungspipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Betazellfunktion und der Mechanismen des Diabetes in kontrollierten, krankheitsrelevanten Systemen.
- Unterstützt die biologische Risikominderung, indem konsistente, hochreine Inseln für mechanistische Studien bereitgestellt werden.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung durch robuste Glukose-stimulierte Insulinsekretionsassays.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte Inselpräparationen für reproduzierbare Wirkstofftests und die Entwicklung von Assays.
- Verringert die manuelle Variabilität und unterstützt quantitative sowie skalierbare Assayergebnisse.
- Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Screening-Plattformen vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht präklinische Transplantation und Diabetes-Modellierung mit funktionell intakten Inseln.
- Unterstützt die Kontinuität von funktionellen In-vitro-Assays zu In-vivo-Wirksamkeitsstudien.
- Passt sich translationalen Biomarker-Strategien an, indem die Vitalität und Funktion der Inseln über die Zeit erhalten bleibt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase und schafft eine Grundlage für die Identifizierung von Leitstrukturen, die mechanistische Risikominimierung und die translationale Validierung in der Diabetesforschung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen unter Verwendung von hochwertigen Inseln.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Auswertungen zur Beurteilung von Substanzen und Standardisierung von Assays.
- Analysen: Bietet sowohl manuelle als auch halbautomatisierte Quantifizierungsmethoden für eine robuste Datenvergleichbarkeit.
- Translationale Forschung: Erhält die Funktion und Vitalität der Inseln für präklinische Transplantationen und die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen skalierbaren und wiederverwendbaren Workflow für laufende Diabetes- und Inselbiologie-Studien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei Diabetesmodellen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Inselzellisolierung und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen Studien.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und eine effizientere Kapitalnutzung, indem zuverlässige biologische Eingangsdaten sichergestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Diabetes-Forschungsprogrammen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in chirurgischen Techniken und der enzymatischen Gewebeaufbereitung.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Geräten für die Perfusion, die Gradientenseparation und die bildbasierte Quantifizierung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Nagetierstämme kann eine Optimierung und Validierung des Protokolls erfordern.
- Die Unterschiede in der Ausbeute und der Quantifizierungsvariabilität zwischen manuellen und automatisierten Methoden sollten bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden.
