Protokoll für Einzelzell-Dissoziation, RNA-Sequenzierung und Isolierung von Myoepithelzellen und Fibroblasten aus den gealterten Lacrimal- und Speicheldrüsen
April 24th, 2026
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Dissoziation alter Maus-Tränendrüsen, um lebensfähige Einzelzellen für die Sequenzierung einzelner RNA zu erhalten. Sequentielle enzymatische Verdauung und sanfte Handhabung erhalten die Zellintegrität und liefern hochwertige Suspensionen, die für zelltypspezifische Isolation und transkriptomische Analyse altersassoziierter Veränderungen in Tränendrüsenpopulationen geeignet sind.
Mein Labor untersucht, wie altersbedingte Veränderungen in Speichel- und Tränendrüsen verschiedene Zelltypen mithilfe von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung beeinflussen. Standard-Dissoziationsmethoden gewinnen empfindliche Epithelzellen aus gealterten Speicheln und Tränendrüsen schlecht zurück. Und mein Protokoll verbessert die Zelllebensfähigkeit und ermöglicht eine zuverlässige Einzelzellanalyse und Zellsortierung.
Zu Beginn positionieren Sie die eingeschläferte Maus im Rücken auf dem Sektionstisch. Mit feiner Pinzette und Schere wird die Haut zwischen Auge und Ohr eingeschnitten. Ziehe die Haut vorsichtig zurück, um die Tränendrüse freizulegen.
Mit einer stumpfen Zange heben Sie die Tränendrüse leicht an. Trennen Sie das umliegende Bindegewebe vorsichtig, indem Sie es vorsichtig in einer kreisenden Bewegung wegziehen. Identifizieren Sie die sichtbaren Grenzen der Tränendrüse und trennen Sie sie von benachbarten Geweben, einschließlich der Parotisdrüse.
Dann übergeben Sie die Tränendrüse in eine 35-Millimeter-Petrischale mit zwei Millilitern kaltem PBS auf Eis. Unter einem Seziermikroskop wird das verbleibende Fett entfernt und die Bindegewebskapsel vorsichtig aus der Tränendrüse entnommen. Stellen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale auf Eis.
Fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter kaltes PBS in die Mitte der Schüssel hinzu und übertragen Sie eine Tränendrüse in das PBS. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe weiterhin in PBS eingetaucht bleibt. Mit zwei sterilen Skalpellen wird die Tränendrüse fein in kleine Fragmente zerkleinert, bis sie eine weiche, pastenartige Konsistenz erreicht.
Sammeln Sie die Gewebefragmente an eine Seite der Schale ein. Aspirieren Sie das Rest-PBS und waschen Sie die Fragmente mit einem Milliliter frisch-kaltem PBS. Die gewaschenen Gewebefragmente werden in eine 12-Well-Platte mit jeweils zwei Millilitern pro Brunnen vorgeheiztes Verdauungsmedium übertragen.
Stellen Sie den Teller in ein schüttelndes Wasserbad und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang mit 37 Grad Celsius und 60 Umdrehungen pro Minute. Mit einer breiten Ein-Milliliter-Pipettenspitze triturieren Sie das Gewebe vorsichtig 15 Mal. Stellen Sie den Teller zurück ins Schüttelwasserbad und bebrüten Sie ihn weitere 30 Minuten.
Anschließend triturieren Sie die Probe mit einer normalen Ein-Milliliter-Pipettenspitze vorsichtig 10 Mal und inkubieren Sie erneut 30 Minuten. Dann triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal und übertragen Sie die Zellsuspension in zwei Milliliter große Delfin-Mikrozentrifugenröhren. Gib jedem Bohrloch der Platte einen Milliliter kaltes Blockierungsmedium eins, oder BM1, hinzu, um das verbleibende Verdauungsmedium mit Restzellen aufzusammeln und die Platte bis zum nächsten Schritt auf Eis zu legen.
Zentrifugiere die Röhren mit der Zellsuspension bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorge das Supernatant aus jedem Rohr. Übertragen Sie das BM1 aus jedem Brunnen der Platte mit Restzellen in das entsprechende Rohr.
Anschließend geben Sie jedem Brunnen 600 Mikroliter kaltes BM1 hinzu, um die verbleibenden Zellen auszuspülen, und übergeben Sie die Waschflüssigkeit in das entsprechende Rohr, um sie mit der Zellsuspension zu verbinden. Lassen Sie die Zellsuspension vorsichtig wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie die Röhren erneut mit 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstandsmittel.
Gib einen Milliliter Accutase zu den Zellpellets und lasse die Zellen vorsichtig wieder suspendieren. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 Grad Celsius und 60 Umdrehungen pro Minute für fünf bis zehn Minuten. Mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal.
Dann gibt man einen Milliliter kaltes BM2 in das Rohr, um die enzymatische Reaktion durch Verdünnung der Accutase zu beenden. Zentrifugiere das Rohr bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant. Gib ein Medium mit DNase 1 in einer Konzentration von 200 Einheiten pro Milliliter in das Rohr, um die Zellen wieder aufzuhängen und das Rohr bis zum oberen Ende zu füllen.
Inkubieren Sie das Rohr 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur und lassen Sie es nach fünf Minuten vorsichtig wieder suspendieren. Setzen Sie währenddessen ein 70-Mikrometer-Sieb über ein 15-Milliliter-Kegelrohr und befeuchten Sie das Sieb mit einem Milliliter BM3 vor. Nach der Inkubation wird die Zellsuspension auf das Sieb übertragen.
Gib einen Milliliter BM3 in das ursprüngliche Sammelrohr, um es auszuspülen, und übertrage die Spülung auf dasselbe Sieb. Waschen Sie das Sieb mit zusätzlichen fünf Millilitern BM3. Schließlich bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Lebensfähigkeit der gefilterten Zellsuspension mittels Trypan-Blau-Fleck und eines automatisierten Zellzählers.
Beginnen Sie mit nachgelagerten Anwendungen, wie der Sequenzierung von Einzelzell-RNA zur Genexpressionsprofilierung oder der Flowzytometrie-basierten Zellsortierung fluoreszenzmarkierter Zellpopulationen. Die UMAP-Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten identifizierte gut vertretene epitheliale und stromale Populationen in der Tränendrüse, darunter Myoepithelzellen und Fibroblasten, sowie vielfältige Immunzellpopulationen. Gealterte Tränendrüsen enthielten reichlich Plasma und aktivierte B-Zellen, die IGHM und IGHD exprimierten.
Das sequentielle Durchflusszytometrie-Gating ermöglichte eine klare Trennung von EpCAM-positiven, GFP-positiven Myoepithelzellen von EpCAM-negativen, GFP-positiven Mauerzellen. GFP-positive Fibroblasten, die PDGFR alpha exprimieren, waren EpCAM-negativ, was eine Unterscheidung von Epithelzellen ermöglichte. Bei PDGFR alpha und EGFP-Mäusen exprimierten alle GFP-positiven Zellen ebenfalls Kollagen eins, was die Identität der Fibroblasten bestätigte.
Die Flowzytometrieanalyse zeigte, dass 99,6 % der GFP-positiven Zellen mit PDGFR-alpha-immungefärbten Zellen korrespondierten. Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, lebensfähige Einzelzellen aus Tränendrüsen zu isolieren, um die molekulare Charakterisierung von Epithel-, Stromal- und Immunpopulationen zu ermöglichen. Die größte Herausforderung besteht darin, mechanischen und enzymatischen Stress während der Dissoziation empfindlichen gealterten Gewebes zu minimieren und gleichzeitig eine hohe Zellviabilität für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aufrechtzuerhalten.
Nach diesem Verfahren können isolierte Zellen für Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Bulk-RNA-Sequenzierung und molekulare Profilierung spezifischer Zellpopulationen verwendet werden. Sortierte Zellen können auch für nachgelagerte funktionelle Assays kultiviert werden.
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Overview
This article presents an optimized protocol for isolating viable single cells from aged mouse lacrimal glands (LGs), enabling high-quality single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and flow cytometry analysis. The method addresses challenges posed by increased fibrosis, cellular fragility, and lipid accumulation in aged LGs, ensuring efficient dissociation and recovery of diverse cell types for downstream molecular profiling.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular biology
- Ophthalmology and exocrine gland research
- Single-cell transcriptomics
Background
- Aging of the lacrimal gland leads to reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease.
- Age-related changes include immune cell infiltration, cellular damage, lipid accumulation, extracellular matrix deposition, and ductal dilation.
- Single-cell RNA sequencing is a powerful tool for profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes during aging.
- Obtaining viable single-cell suspensions from aged LGs is technically challenging due to tissue fragility and fibrosis.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for efficient dissociation of aged mouse lacrimal glands.
- To enable isolation of multiple cell types suitable for scRNA-seq and flow cytometry.
- To minimize cell damage and maximize viability during tissue processing.
Methods Used
- Careful dissection and mincing of lacrimal gland tissue from euthanized mice.
- Stepwise enzymatic digestion using Collagenase IV, Dispase II, DNase I, and Accutase.
- Use of pre-coated plasticware and controlled temperature/agitation to reduce cell stress.
- Red blood cell lysis and sequential filtration through strainers to enhance cell purity.
- Cell type-specific isolation using reporter mouse lines (Acta2GFP and PdgfraEGFP) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) after immunostaining with EpCAM antibody.
Main Results
- The protocol yields high-quality, viable single-cell suspensions from both aged and young lacrimal glands.
- UMAP analysis of scRNA-seq data identified well-represented epithelial, stromal, and diverse immune cell populations.
- FACS enabled clear separation and identification of myoepithelial cells (EpCAM+, GFP+) and fibroblasts (PDGFRα+, EpCAM-).
- In aged LGs, abundant plasma and activated B cells expressing IGHM and IGHD were detected.
- 99.6% of GFP-positive cells corresponded to PDGFRα-immunostained fibroblasts, confirming cell identity.
Conclusions
- This protocol enables efficient and gentle dissociation of aged lacrimal glands for single-cell analysis.
- It supports high cell viability and recovery of multiple cell types, including fragile epithelial and stromal populations.
- The method is adaptable to other fibrotic or aging exocrine tissues requiring targeted cell isolation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient single-cell dissociation and isolation from aged lacrimal and salivary glands addresses a critical bottleneck in profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes associated with tissue aging and fibrosis. This protocol enables high-viability recovery of fragile epithelial and stromal populations, supporting robust single-cell RNA sequencing and targeted cell sorting for discovery-stage research. The method enhances predictive confidence in cell-type specific molecular characterization, informing early target validation and mechanistic de-risking in exocrine gland disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of age-related cellular and molecular changes in exocrine tissues.
- Supports functional target validation by isolating viable myoepithelial cells and fibroblasts for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality single-cell suspensions for transcriptomic profiling.
- Improves predictive confidence in disease-relevant system modeling for dry eye and related disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions suitable for high-throughput scRNA-seq and flow cytometry workflows.
- Standardizes dissociation and isolation steps to maximize reproducibility and quantitative output quality.
- Enables reliable cell-type specific sorting using FACS and reporter mouse lines for assay development.
- Supports scalable adaptation to other fibrotic or aging exocrine tissues with similar dissociation challenges.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling outputs with disease-relevant biomarkers in aged tissue models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional assays on sorted cell populations.
- Reduces biological risk in translational studies by ensuring high cell viability and purity for downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis and targeted cell isolation from challenging aged tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in age-related exocrine gland dysfunction.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity single-cell suspensions for quantitative transcriptomic and cytometric assays.
- Analytics: Provides cell-type resolved molecular data and enables statistical comparison of cellular populations across age groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and functional validation in disease-relevant aged tissue models.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse exocrine tissues, supporting platform scalability and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-type specific analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell workflows in aged and fibrotic tissues.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting exocrine gland dysfunction and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic dissociation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to automated cell counters, FACS instrumentation, and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and sorting protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of enzyme concentrations and incubation times.
- Cell viability and yield may be limited by tissue fibrosis and cellular fragility in advanced aging models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
