Protokoll für Einzelzell-Dissoziation, RNA-Sequenzierung und Isolierung von Myoepithelzellen und Fibroblasten aus den gealterten Lacrimal- und Speicheldrüsen

Mein Labor untersucht, wie altersbedingte Veränderungen in Speichel- und Tränendrüsen verschiedene Zelltypen mithilfe von Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung beeinflussen. Standard-Dissoziationsmethoden gewinnen empfindliche Epithelzellen aus gealterten Speicheln und Tränendrüsen schlecht zurück. Und mein Protokoll verbessert die Zelllebensfähigkeit und ermöglicht eine zuverlässige Einzelzellanalyse und Zellsortierung.

Zu Beginn positionieren Sie die eingeschläferte Maus im Rücken auf dem Sektionstisch. Mit feiner Pinzette und Schere wird die Haut zwischen Auge und Ohr eingeschnitten. Ziehe die Haut vorsichtig zurück, um die Tränendrüse freizulegen.

Mit einer stumpfen Zange heben Sie die Tränendrüse leicht an. Trennen Sie das umliegende Bindegewebe vorsichtig, indem Sie es vorsichtig in einer kreisenden Bewegung wegziehen. Identifizieren Sie die sichtbaren Grenzen der Tränendrüse und trennen Sie sie von benachbarten Geweben, einschließlich der Parotisdrüse.

Dann übergeben Sie die Tränendrüse in eine 35-Millimeter-Petrischale mit zwei Millilitern kaltem PBS auf Eis. Unter einem Seziermikroskop wird das verbleibende Fett entfernt und die Bindegewebskapsel vorsichtig aus der Tränendrüse entnommen. Stellen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale auf Eis.

Fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter kaltes PBS in die Mitte der Schüssel hinzu und übertragen Sie eine Tränendrüse in das PBS. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe weiterhin in PBS eingetaucht bleibt. Mit zwei sterilen Skalpellen wird die Tränendrüse fein in kleine Fragmente zerkleinert, bis sie eine weiche, pastenartige Konsistenz erreicht.

Sammeln Sie die Gewebefragmente an eine Seite der Schale ein. Aspirieren Sie das Rest-PBS und waschen Sie die Fragmente mit einem Milliliter frisch-kaltem PBS. Die gewaschenen Gewebefragmente werden in eine 12-Well-Platte mit jeweils zwei Millilitern pro Brunnen vorgeheiztes Verdauungsmedium übertragen.

Stellen Sie den Teller in ein schüttelndes Wasserbad und inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang mit 37 Grad Celsius und 60 Umdrehungen pro Minute. Mit einer breiten Ein-Milliliter-Pipettenspitze triturieren Sie das Gewebe vorsichtig 15 Mal. Stellen Sie den Teller zurück ins Schüttelwasserbad und bebrüten Sie ihn weitere 30 Minuten.

Anschließend triturieren Sie die Probe mit einer normalen Ein-Milliliter-Pipettenspitze vorsichtig 10 Mal und inkubieren Sie erneut 30 Minuten. Dann triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal und übertragen Sie die Zellsuspension in zwei Milliliter große Delfin-Mikrozentrifugenröhren. Gib jedem Bohrloch der Platte einen Milliliter kaltes Blockierungsmedium eins, oder BM1, hinzu, um das verbleibende Verdauungsmedium mit Restzellen aufzusammeln und die Platte bis zum nächsten Schritt auf Eis zu legen.

Zentrifugiere die Röhren mit der Zellsuspension bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorge das Supernatant aus jedem Rohr. Übertragen Sie das BM1 aus jedem Brunnen der Platte mit Restzellen in das entsprechende Rohr.

Anschließend geben Sie jedem Brunnen 600 Mikroliter kaltes BM1 hinzu, um die verbleibenden Zellen auszuspülen, und übergeben Sie die Waschflüssigkeit in das entsprechende Rohr, um sie mit der Zellsuspension zu verbinden. Lassen Sie die Zellsuspension vorsichtig wieder suspendieren. Zentrifugieren Sie die Röhren erneut mit 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstandsmittel.

Gib einen Milliliter Accutase zu den Zellpellets und lasse die Zellen vorsichtig wieder suspendieren. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 Grad Celsius und 60 Umdrehungen pro Minute für fünf bis zehn Minuten. Mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze triturieren Sie die Probe vorsichtig 10 Mal.

Dann gibt man einen Milliliter kaltes BM2 in das Rohr, um die enzymatische Reaktion durch Verdünnung der Accutase zu beenden. Zentrifugiere das Rohr bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorge das Supernatant. Gib ein Medium mit DNase 1 in einer Konzentration von 200 Einheiten pro Milliliter in das Rohr, um die Zellen wieder aufzuhängen und das Rohr bis zum oberen Ende zu füllen.

Inkubieren Sie das Rohr 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur und lassen Sie es nach fünf Minuten vorsichtig wieder suspendieren. Setzen Sie währenddessen ein 70-Mikrometer-Sieb über ein 15-Milliliter-Kegelrohr und befeuchten Sie das Sieb mit einem Milliliter BM3 vor. Nach der Inkubation wird die Zellsuspension auf das Sieb übertragen.

Gib einen Milliliter BM3 in das ursprüngliche Sammelrohr, um es auszuspülen, und übertrage die Spülung auf dasselbe Sieb. Waschen Sie das Sieb mit zusätzlichen fünf Millilitern BM3. Schließlich bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Lebensfähigkeit der gefilterten Zellsuspension mittels Trypan-Blau-Fleck und eines automatisierten Zellzählers.

Beginnen Sie mit nachgelagerten Anwendungen, wie der Sequenzierung von Einzelzell-RNA zur Genexpressionsprofilierung oder der Flowzytometrie-basierten Zellsortierung fluoreszenzmarkierter Zellpopulationen. Die UMAP-Analyse von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten identifizierte gut vertretene epitheliale und stromale Populationen in der Tränendrüse, darunter Myoepithelzellen und Fibroblasten, sowie vielfältige Immunzellpopulationen. Gealterte Tränendrüsen enthielten reichlich Plasma und aktivierte B-Zellen, die IGHM und IGHD exprimierten.

Das sequentielle Durchflusszytometrie-Gating ermöglichte eine klare Trennung von EpCAM-positiven, GFP-positiven Myoepithelzellen von EpCAM-negativen, GFP-positiven Mauerzellen. GFP-positive Fibroblasten, die PDGFR alpha exprimieren, waren EpCAM-negativ, was eine Unterscheidung von Epithelzellen ermöglichte. Bei PDGFR alpha und EGFP-Mäusen exprimierten alle GFP-positiven Zellen ebenfalls Kollagen eins, was die Identität der Fibroblasten bestätigte.

Die Flowzytometrieanalyse zeigte, dass 99,6 % der GFP-positiven Zellen mit PDGFR-alpha-immungefärbten Zellen korrespondierten. Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, lebensfähige Einzelzellen aus Tränendrüsen zu isolieren, um die molekulare Charakterisierung von Epithel-, Stromal- und Immunpopulationen zu ermöglichen. Die größte Herausforderung besteht darin, mechanischen und enzymatischen Stress während der Dissoziation empfindlichen gealterten Gewebes zu minimieren und gleichzeitig eine hohe Zellviabilität für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aufrechtzuerhalten.

Nach diesem Verfahren können isolierte Zellen für Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Bulk-RNA-Sequenzierung und molekulare Profilierung spezifischer Zellpopulationen verwendet werden. Sortierte Zellen können auch für nachgelagerte funktionelle Assays kultiviert werden.