Name: Evaluierung von 3D-Sphäroiden für AAV-Transduktionsstudien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung von AAV-Vektoren in 3D-Sphäroiden für Gentherapie-Entwicklung. Diese Methode ermöglicht quantitative Echtzeitanalyse von Transduktionseffizienz und Serotyp-Spezifität.

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Die Autoren danken Morten Seirup und Trish Hoang für die Bereitstellung des Plasmids für die Herstellung von AAV-Nanoluciferase sowie der Reagenzien für den Live-Substratnachweis. Dieses Projekt wurde durch eine Zuteilung zum ORISE-Forschungsteilnehmerprogramm am CBER, U.S. Food and Drug Administration, unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education im Rahmen einer interagenturenübergreifenden Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und der FDA verwaltet wird.

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	<li>Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier stellen wir eine optimierte in vitro&#160;3D-Plattform für die Entwicklung und Potenzprüfung von AAVs vor. Diese Plattform nutzt eine verbesserte Transduktion, hohe Empfindlichkeit und eine bessere Übertragbarkeit aufgrund einer dreidimensionalen Zellkultur, die der Architektur menschlichen Gewebes stärker ähnelt. Mit diesem System lässt sich die Transduktionseffizienz zwischen verschiedenen AAV-Serotypen und regulatorischen Elementen – einschließlich einsträngiger und selbstkomplementärer Vektoren – in mehreren Zelllinien erfolgreich unterscheiden. Im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Assays, bei denen die Transduktionseffizienz oft als Prozentsatz transgen-positiver Zellen definiert wird, erlaubt das 3D-Sphäroid-System keine Quantifizierung mit Einzelzellauflösung. Daher wird die Transduktionseffizienz in dieser Studie als Gesamtintensität des Reporter-Signals (fluoreszierend oder lumineszierend) definiert, die den kombinierten Einfluss des Anteils transduzierter Zellen und des Expressionsniveaus des Transgens pro Zelle widerspiegelt. Die hohe Empfindlichkeit der Sphäroide reduziert den Bedarf an hohen Produktmengen erheblich und macht das System kosteneffizient, vielseitig und physiologisch relevant für die Forschung und Entwicklung von AAVs.
Dieser Ansatz behebt wesentliche Probleme herkömmlicher 2D-Zellkultursysteme, die auf der Adhäsion an künstlichen Oberflächen beruhen und eine zelluläre Organisation fehlt, was möglicherweise&#160;zu ungenauen Vorhersagen der Vektorleistung in klinischen Anwendungen führen kann. Das 3D-Sphäroid-System ahmt die Gewebestruktur und die Muster der Arzneimitteldistribution besser nach und liefert Daten zum Vektorverhalten, die realen biologischen Bedingungen näherkommen22,23. Das Protokoll verwendet einfache Ultra-Low-Attachment-Platten, wodurch es in Standard-Laborumgebungen leicht reproduzierbar ist.
Dieses anpassungsfähige System könnte für AAV-Neutralisationsassays verwendet werden, um die AAV-Penetration zu untersuchen, und um komplexere Ko-Kultur-Experimente zu entwickeln, mit denen die Auswirkungen unterschiedlicher zellulärer Umgebungen auf die AAV-Transduktion analysiert werden können. Außerdem lassen sich Hochdurchsatz-Screening-Plattformen für Wirkstoffe und Vektoren problemlos in die Sphäroid-Plattform integrieren, wodurch die Automatisierung und Kostensenkung in den Arbeitsabläufen zur Vektorentwicklung für gezieltere Produkte ermöglicht wird.
Ein wesentlicher praktischer Vorteil von Sphäroiden ist ihre Fähigkeit, wochenlang kontinuierlich zu wachsen, ohne dass eine Zellpassage erforderlich ist, wodurch langfristige Untersuchungen der AAV-Aktivität ermöglicht werden. Dieses stabile Kultursystem erhält wichtige Zell-Zell-Interaktionen und Matrixbestandteile aufrecht und vermeidet Unterbrechungen, die durch wiederholte Zellerntebedingungen in 2D-Kulturen verursacht werden24. Die erhaltene zelluläre Umgebung unterstützt die natürliche Organisation von Proteinen und Membranstrukturen, die für die Beurteilung der AAV-Bindung und des Zelleintritts unerlässlich sind25.
Obwohl 3D-Sphäroide ein großes Potenzial für die Beurteilung der AAV-Transduktion aufweisen, weisen sie im Vergleich zu in-vivo&#160;Modellen auch einige translationale Nachteile auf, hauptsächlich aufgrund ihrer im Vergleich zu nativen Geweben vereinfachten Struktur. Sphäroide fehlen wichtige physiologische Komponenten, darunter Gefäßsysteme für die Vektordosierung, Immunzellen zur Beurteilung der Immunogenität sowie gewebespezifische Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke, die die AAV-Leistung erheblich beeinflussen könnten26. Diese Einschränkungen zeigen, dass Sphäroide, trotz ihres mittleren Komplexitätsgrads zwischen konventionellen 2D-Kulturen und in-vivo-Tiermodellen, weiterhin unzureichend sind, um das physiologische Mikromilieu, das für eine umfassende AAV-Bewertung erforderlich ist, vollständig nachzubilden.
Das hier vorgestellte Sphäroid-Protokoll beschreibt jeweils einen einzelnen Zelltyp. Dieses Protokoll kann weiterentwickelt werden, um 2–3 zusätzliche Zelltypen einzubeziehen, die sich zu einer grundlegenden dreidimensionalen Struktur aggregieren. Komplexere 3D-Modelle wie Organoiden oder Mikrofluidiksysteme sind multizelluläre Systeme, die die zelluläre Diversität und Organisation spezifischer Organe nachbilden und 10 oder mehr unterschiedliche Zelltypen enthalten, die in gewebeähnlichen Mustern angeordnet sind. Solche fortgeschrittenen 3D-Organoiden können mehrere Zellen27, in Hydrogelen eingebettete Kulturen, Hanging-Drop-Techniken und mikrofluidische Plattformen11,27,28 umfassen. Obwohl diese Methoden komplexere Gewebearchitekturen bereitstellen, die zum tieferen Verständnis der AAV-Biologie beitragen könnten, erfordern sie in der Regel spezialisiertere Reagenzien, Ausrüstung und erhebliches technisches Fachwissen. Im Gegensatz dazu sind 3D-Sphäroide, die in Platten mit ultra-niedriger Anhaftung gebildet werden, deutlich einfacher und aufgrund ihrer Kosteneffizienz und Reproduzierbarkeit für viele Labore geeignet.
Zu den kritischen Schritten für eine erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls gehört die Aufrechterhaltung einer hohen Zellviabilität, da geschädigte Zellen die Sphäroidbildung und die Transduktionseffizienz beeinträchtigen können. Die Verwendung von Platten mit ultra-niedriger Anhaftung sowie die Optimierung der Zentrifugation sind ebenfalls entscheidend, um eine kompakte Sphäroidstruktur zu erzielen. Die Optimierung der MOI für jeden Zelltyp und AAV-Serotyp ist unerlässlich, um schwache Signale oder Sättigungseffekte zu vermeiden. Auch die Wahl der geeigneten Nachweismethode ist besonders wichtig, insbesondere bei kinetischen Analysen, bei denen die Kompatibilität mit kontinuierlichen Live-Cell-Imaging-Systemen erforderlich ist. Mehrere technische Aspekte sind wichtig für eine korrekte Interpretation der AAV-Transduktion in 3D-Sphäroiden.
Ein schwaches oder fehlendes Transduktionssignal kann auf eine niedrige Virus-Titer, ein suboptimales MOI oder eine unzureichende Inkubationszeit zurückzuführen sein; dies lässt sich durch die Überprüfung der Virustiter, die Optimierung des MOI und die Verlängerung der Inkubationszeit (typischerweise 3–5 Tage) beheben. Schwache Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignale können auf eine geringe Transgenexpression oder eingeschränkte Reagenzpenetration in der dreidimensionalen Struktur hindeuten, was durch die Optimierung der Belichtungseinstellungen oder zusätzliche Zeit für die Substratdiffusion verbessert werden kann. Eine wesentliche Herausforderung bei bestimmten Zelllinien, wie beispielsweise HeLa-Zellen, ist die Autofluoreszenz, die zu einem hohen Hintergrundsignal und einer verminderten Empfindlichkeit in fluoreszenzbasierten Assays führen kann. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein lumineszenzbasiertes Nanoluciferase-Reportersystem implementiert, das ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bietet und eine genauere Detektion der Transduktion in autofluoreszierenden Hintergründen ermöglicht. Außerdem kann ein Hintergrundsignal durch falsche Schwellenwerteinstellungen oder fluoreszenzbedingte Effekte des Kulturmediums entstehen und sollte daher mittels unbehandelter Vertiefungen (MOI = 0) kontrolliert werden, um die Basislinie festzulegen. Schließlich kann eine Signalsättigung bei hohen MOIs aufgrund eines übermäßigen Virusinputs oder detektorbedingter Grenzen auftreten; dies lässt sich durch eine Verringerung des MOI-Bereichs und die Optimierung der Detektorbelichtungseinstellungen verhindern, um die Messungen im linearen dynamischen Bereich zu halten.
Insgesamt bietet diese 3D-Sphäroid-Methode ein optimiertes, reproduzierbares System zur Bewertung der AAV-Transduktion, Wirksamkeit und Kinetik. Indem sie die Lücke zwischen konventionellen 2D-Assays und in vivo-Studien schließt, ermöglicht sie eine fundiertere Vektorentwicklung und unterstützt die Weiterentwicklung klinisch relevanter Gentherapiestrategien.

AAV-Vektoren haben sich aufgrund ihres Sicherheitsprofils und ihrer Fähigkeit, eine dauerhafte Genexpression zu erreichen, zu einem der bevorzugten Systeme für die Genübertragung in vivo entwickelt1. Die AAV-Gen Therapie zeigt Erfolge bei der Behandlung mehrerer seltener Erkrankungen, wobei sich hunderte Produkte in der Entwicklungsphase befinden2. Zudem umfassen neuartige Anwendungen die in vivo-Abgabe von Komponenten der Genom-Editierung, wie beispielsweise Cas9, die ein großes Potenzial besitzen, bei der Behandlung schwer therapierbarer Erkrankungen zu helfen3. Zu den zentralen Entwicklungsherausforderungen zählen hohe Herstellungskosten sowie die begrenzte Vorhersagekraft aktueller in vitro-Assays hinsichtlich Produktqualität und klinischer Wirksamkeit4.
Die Weiterentwicklung von AAV-Therapeutika wird grundlegend durch den Mangel an vorhersagbaren, standardisierten Aktivitätsassays eingeschränkt, die die klinische Wirksamkeit genau prognostizieren können4,5. Solche Assays sind eine entscheidende Komponente der Entwicklungs-Pipeline, da sie für mehrere Zwecke eingesetzt werden, darunter das Durchmustern von Bibliotheken modifizierter Vektoren, die Optimierung von Kapsid-Modifikationen zur Verbesserung der Zielgerichtetheit und die Bewertung der gewebespezifischen Tropismus. Sie dienen zudem dazu, den Einfluss regulatorischer Sequenzen auf die Transgenexpression zu charakterisieren6. Über die Kandidatenauswahl hinaus unterstützen AAV-Transduktionsassays auch wesentliche Qualitätskontrollen in der Herstellung, und zwar durch Potenzassays, die für die Freigabe von Chargen, Chargenvergleichsstudien und Stabilitätsbewertungen verwendet werden6,7.
Die wissenschaftliche Herausforderung besteht darin, Assays zu entwickeln, die die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Vektor und Wirt erfassen, gleichzeitig aber praktikabel genug sind, um routinemäßig eingesetzt werden zu können7,8. Zu den derzeitigen Ansätzen zählt die Nutzung immortaler Zelllinien, die das Zielorgan in herkömmlichen zweidimensionalen Monoschichtkulturen repräsentieren. Diese Kulturbedingungen weisen eine geringe physiologische Relevanz auf und erfordern hohe Wirkstoffdosen. Dies führt zu einer erheblichen Diskrepanz zwischen Laborvorhersagen und klinischer Übertragbarkeit. Neuartige, gezielt modifizierte Zelllinien, wie Systeme mit Überexpression von AAVR oder CRISPR-Aktivierung, stellen wichtige Fortschritte dar, können jedoch die dreidimensionale Architektur und die Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix, wie sie in nativen Geweben vorkommen, nicht nachbilden9,10,11. Modelle der nächsten Generation, die in vivo-Mikroumgebungen besser simulieren, könnten diese translationale Kluft überbrücken12,13,14.
Kürzlich haben wir ein auf die AAV-Transduktion optimiertes 3D-Sphäroid-System entwickelt, um die Übertragbarkeit von AAV-Transduktionsassays zu verbessern. Im Vergleich zu den etablierten 2D-Assays steigert dieses System die Effizienz der AAV-Transduktion signifikant über mehrere Zelllinien und AAV-Serotypen hinweg. Neben der erhöhten Empfindlichkeit und der geringeren Menge an benötigtem Produkt ermöglichen diese Modelle im Gegensatz zu 2D-Monolagen realistische Zell-Zell-Interaktionen, die je nach zellulärem Ort innerhalb des Sphäroids variieren. Zudem erlauben sie aussagekräftige Untersuchungen zur Penetration von Wirkstoffen unter Bedingungen, die tatsächlichen Organverhältnissen ähneln11,15,16. Darüber hinaus bietet der Sphäroid-Ansatz praktische Vorteile gegenüber komplexeren Organoid- oder Ko-Kultursystemen, da er auf Standardlaborgeräten basiert und auf spezialisierte Kulturmedien oder Trägermaterialien verzichtet. Diese Einfachheit gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit und macht das System besonders geeignet für routinemäßige Tests in der Gentherapie sowie für die Entwicklung von Vektoren17.
Diese 3D-Sphäroid-Plattform eignet sich besonders gut für Anwendungen, die eine empfindliche Detektion der AAV-Transduktion bei niedrigen Dosen und eine vergleichende Bewertung von Vektorgenom-Designs erfordern. Sie ermöglicht außerdem die Beurteilung serotypabhängiger Tropismen. Besonders vorteilhaft ist sie für Zelllinien mit relativ geringer Transduktionseffizienz, die in herkömmlichen 2D-Kulturen hohe AAV-Dosen benötigen. In diesen Fällen sind die erhöhte Empfindlichkeit und die verbesserte physiologische Relevanz der 3D-Plattform entscheidend. Dieses System ist jedoch weniger geeignet für Studien, die Immunbestandteile, vaskuläre Zufuhr oder vollständige Gewebekomplexität erfordern, da Sphäroide die in vivo&#160;-Umgebung nicht vollständig nachbilden.
Daher stellen wir ein einfaches 3D-Sphäroid-Protokoll vor, das für AAV-Transduktionsassays optimiert ist und zwei entscheidende und komplementäre Endpunkte umfasst: die Transduktionseffizienz (hier definiert als Gesamtsignal des Reportergens pro Sphäroid) und die Transduktionskinetik. Diese Methode bietet eine kostengünstige, physiologisch relevante und aussagekräftige Plattform zur Bewertung der AAV-Potenz, Vektordesigns und Neutralisationsassays.

<table><tbody><tr><td>37 °C-Inkubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Standardkulturbedingungen</td></tr><tr><td>A375-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>AAV1-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>AAV-Plasmid</td></tr><tr><td>AAV2-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>AAV-Plasmid</td></tr><tr><td>AAV5-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>AAV-Plasmid</td></tr><tr><td>AAV8-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>AAV-Plasmid</td></tr><tr><td>AAV9-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>AAV-Plasmid</td></tr><tr><td>BioTek GEN5-Plattenreader</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Endpunktanalyse für Fluoreszenz oder Lumineszenz</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Aufrechterhaltung der Sphäroid-Suspension</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; Zellkultur-Phosphatpufferlösung (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS zum Spülen der Zellen</td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt, GlutaMAX-Zusatz, Pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Vollständiges Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Extrazellulärer NanoLuc-Inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Unterdrückt jedes Nanoluc&amp;reg;-Signal aus der extrazellulären Umgebung&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Lieferung von Wachstumsfaktoren</td></tr><tr><td>HEK293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>HEP3B-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>HEPG2-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>Huh7-Zellen</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Zelllinie</td></tr><tr><td>IncuCyte S3 inverses Mikroskop</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Überwachung der Sphäroidbildung/-vermehrung</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum-Bildgebungssystem</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Endpunktanalyse für Lumineszenz</td></tr><tr><td>Nano-Glo&amp;reg; Live-Cell-Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Lumineszenter Substratreagenz für die Detektion lebender Zellen</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Verhinderung bakterieller Kontamination</td></tr><tr><td>T75-Zellkulturgefäße mit Belüftung</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Gefäße zum Zellkultivieren</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Enzymatische Ablösung der Zellen</td></tr><tr><td>Ultra-niedrig bindende Platten</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Verhinderung der Zelladhäsion zur Förderung der Sphäroidbildung</td></tr></tbody></table>

evaluierung von 3d-sphäroiden für aav-transduktionsstudien

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind leistungsfähige Vektoren, die für die Gentransfertherapie in Gentherapeutika verwendet werden. Ihre Entwicklung erfordert in vitro&#160;-Systeme, die zuverlässig Unterschiede in Vektordesign, Serotyp-Leistung, Stärke regulatorischer Elemente und Expressionskinetik nachweisen können. Diese Systeme müssen außerdem Anwendungen wie die Wirksamkeitsprüfung und Vektoroptimierung unterstützen. Hier beschreiben wir eine optimierte dreidimensionale Sphäroid-Plattform, die zur Bewertung der AAV-Wirksamkeit, der Kinetik der Transgenexpression und der serotypspezifischen Transduktionseffizienz in verschiedenen Zelllinien dient. Gleichmäßige Sphäroide werden mithilfe von Platten mit ultra-niedriger Anheftung erzeugt und unter Bedingungen kultiviert, die eine stabile Architektur und Langzeit-Bildgebung ermöglichen. Nach der AAV-Transduktion werden fluoreszierende oder lumineszierende Signale in Echtzeit mittels Live-Cell-Bildgebungssystemen überwacht. Dies ermöglicht eine quantitative Beurteilung des Reporter-Signals, der Dosisabhängigkeit, der Aktivität regulatorischer Elemente und des Einsetzzeitpunkts durch kontinuierliche kinetische Bildgebung. Die Plattform kann effektiv zwischen wirksamen und schwachen Vektorgenom-Designs sowie zwischen mehreren AAV-Serotypen unterscheiden. Diese Methode zeigt eine robuste Leistung sowohl in langsam als auch in schnell teilenden Zelllinien. Diese Ergebnisse belegen ihre Eignung als skalierbares und physiologisch relevante System für die präklinische Bewertung und Entwicklung von Gentherapien.

Dreidimensionale Sphäroid-Kultursysteme verbessern konventionelle zweidimensionale Modelle für die Entwicklung der AAV-Gen Therapie. Diese Methode ermöglicht einen empfindlichen Nachweis der AAV-Transduktion bei niedrigen Dosen, eine erhöhte physiologische Relevanz sowie eine robuste Langzeitüberwachung. Die Plattform unterstützt die Wirksamkeitsbewertung, Hochdurchsatz-Screenings und die Vektoroptimierung über verschiedene Zelllinien und AAV-Serotypen hinweg.

Evaluierung von 3D-Sphäroiden für AAV-Transduktionsstudien

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) sind potente Vektoren, die für den Gentransfer in Gentherapieprodukten eingesetzt werden. Ihre Entwicklung erfordert In-vitro-Systeme, die ...

Wir haben eine empfindliche, physiologisch relevante 3D-Sphäroid-Plattform entwickelt, um die Transduktionsaktivität von AAV zu bewerten und die Vorhersage der Vektorleistung für die Gentherapie zu verbessern. Dieses Protokoll eignet sich zur Evaluierung der AAV-Aktivität in der Vektor-Potenzprüfung, Serotyp-Screening, Optimierung von Transgenen, Neutralisationsstudien sowie der präklinischen Gentherapie in vitro.Zunächst die Zellen unter Standardbedingungen in einer T75-Zellkulturschale bis zu einer Konfluenz von 70 % kultivieren. Nach der Trypsinisierung der Zellen eine 1:10-Verdünnung für die routinemäßige Zellpassage herstellen. Die Zellen erneut bis zur 70%igen Konfluenz inkubieren und anschließend ernten. Nach der Bestimmung der Zellviabilität die Zellsuspension gründlich pipettieren, um eine gleichmäßige Durchmischung sicherzustellen. Führen Sie in einer Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platte Verdünnungsreihen mit Verdünnungsfaktor zwei durch, beginnend mit 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 200 µL. Gemäß dem dargestellten experimentellen Aufbau ein Volumen vollständiges Medium zu allen Reihen hinzufügen, mit Ausnahme der oberen Reihe. Danach zwei Volumina mit 1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in die obere Reihe geben. Verdünnen Sie Reihe 1A seriell, indem ein Volumen aus Reihe 1A in Reihe 1B überführt wird, und fahren Sie entsprechend fort. Die Ultra-Low-Attachment-Platte mit 350 × g fünf Minuten lang zentrifugieren, um die Zellen in die Mitte zu sammeln und den Zell-Zell-Kontakt zu fördern. Zur Sphäroidbildung 24 bis 48 Stunden lang ungestört bei 37 °C inkubieren. Drei Tage einhalten, bis der Durchmesser etwa 400 µm erreicht. Die Gleichmäßigkeit der Sphäroidgröße überprüfen und sicherstellen, dass die Zellen gleichmäßig resuspendiert und die Platten waagerecht liegen. Die Morphologie der Sphäroide beobachten. Ausgereifte Sphäroide auswählen, die eine enge Zell-Zell-Adhäsion aufweisen, im Gegensatz zu lockeren Zellaggregaten.Nachdem die Zellsuspensionen zentrifugiert wurden, überführen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator, der mit einem Live-Cell-Imaging-Gerät ausgestattet ist. Melden Sie sich am Aufnahmesoftware an. Wählen Sie „Schedule to acquire“ und „Scan on schedule“, dann „Create vessel“ auf „New“. Wählen Sie anschließend den Scan-Typ und selektieren Sie „Spheroid“. Wählen Sie die gewünschten Kanäle aus. Wählen Sie Phase mit Hellfeld. Danach wählen Sie grün oder rot. Stellen Sie die gewünschte Vergrößerung auf 10x ein. Wählen Sie das Plattenmodell und dessen Position in der Schublade. Wählen Sie die zu bildenden Vertiefungen aus und geben Sie den Experimentnamen ein. Für die Analyseeinrichtung wählen Sie vorerst keine „Differ analysis“. Stellen Sie ein, dass alle sechs Stunden ein Scan hinzugefügt wird, und scannen Sie unbestimmt lange weiter. Prüfen Sie täglich das Wachstum der Sphäroide, indem Sie sich an der Imaging-Software anmelden. Wählen Sie „View recent scans“ und doppelklicken Sie auf das gewünschte Experiment. Nachdem Sie im Bildkanalbereich „Brightfield“ ausgewählt haben, verwenden Sie die Funktion „Measure image“, um die Durchmesser der Sphäroide zu messen. Entfernen Sie die Platte am Tag der optimalen Sphäroidbildung und verwenden Sie sie für die Adeno-assoziierte Virus- (AAV-)Transduktion.Bereiten Sie eine 96-Loch-Rundbodenplatte vor, die 297 Mikroliter DMEM mit 2 % FBS, aber ohne Antibiotika, enthält. Geben Sie 33 Mikroliter AAV-Stammlösung zum Medium hinzu, um eine initiale Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 × 10⁶ zu erreichen. Bereiten Sie anschließend zehnfache serielle Verdünnungen vor, indem Sie jeweils 33 Mikroliter jeder Verdünnung in 297 Mikroliter Medium übertragen. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette vollständig das Medium aus der zuvor vorbereiteten Sphäroid-Platte. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der gewünschten MOI der AAV-Lösung aus der Verdünnungsplatte auf die Behandlungsplatte. Stellen Sie die Platten zurück in das Bildgebungsinstrument. Beginnen Sie mit der Überwachung der Transduktion, indem Sie über einen Zeitraum von 72 Stunden die grüne Fluoreszenzintensität verfolgen. Ergänzen Sie alle drei Tage 100 Mikroliter vollständiges DMEM pro Loch, um die Nährstoffe aufzufüllen. Stellen Sie die Platte erneut in das Bildgebungsinstrument und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Transduktionseffizienz im Abstand von sechs Stunden. Analysieren Sie die Daten, indem Sie eine Analyse-Definition erstellen, die spezifisch auf die betreffenden Zellen und Reportergene zugeschnitten ist. Führen Sie die Endpunkt-Analyse anhand von Fluoreszenz-Signalen durch. Führen Sie analog dazu die AAV-Transduktion in 3D-Sphäroiden mit lumineszenten Reportern durch, gefolgt von der Transduktionsanalyse mittels Biolumineszenz-Bildgebung.Jede Zelllinie wies nach drei Tagen der Aussaat unterschiedliche morphologische Merkmale und variierende Verdichtungsgrade auf. Hepatische Zelllinien bildeten kompaktere, dichtere Sphäroide als andere Zelllinien. HEK293T bildete ein sehr rundes, sphärisches Erscheinungsbild mit einem deutlichen nekrotischen Kern aus. A375 bildete ein unregelmäßig geformtes Zellaggregat. Die Sphäroide waren hochanfällig für AAV-Transduktion, wobei eine starke Transduktion bei sehr niedrigen AAV-Titern in verschiedenen Zelllinien für selbstkomplementäres GFP nachgewiesen wurde. Die Transduktion von einzelsträngigem GFP in Sphäroiden wurde in geringerem Maße als bei selbstkomplementärem GFP beobachtet. Ein 100-facher Unterschied in der relativen Fluoreszenz wurde zwischen den selbstkomplementären und einzelsträngigen Transgenen bei einem MOI von 10 zur Potenz 6 in HEK293T-Zellen festgestellt. Ein dreifacher Unterschied in der relativen Fluoreszenz wurde zwischen den selbstkomplementären und einzelsträngigen Transgenen in HEP3B-Zellen beobachtet. Alle vier AAV-Serotypen konnten sowohl mit dem fluoreszierenden Plattenreader als auch mit dem Live-Cell-Imaging-System erfolgreich nachgewiesen werden. AAV2 zeigte die höchste Transduktionseffizienz, gefolgt von AAV1 in beiden Zelllinien. Alle AAV-Serotypen zeigten eine effiziente Transduktion im lumineszenten System, was eine präzise Differenzierung der Transduktionseffizienz ermöglichte. AAV2 war der wirksamste Serotyp in HeLa-Sphäroiden, während AAV9 die geringste Transduktionseffizienz aufwies. Die Transduktion von AAV2 mit selbstkomplementärem GFP war bereits bei Infektionsraten von lediglich 10 zur Potenz 1 nachweisbar, mit einer deutlichen Signalzunahme nach etwa 34 Stunden im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Das Signal von AAV2 mit einzelsträngigem GFP war schwächer und langsamer als das von selbstkomplementärem GFP.Die zentrale Herausforderung bei der Durchführung dieses Protokolls besteht darin, eine hohe Zellviabilität aufrechtzuerhalten, gleichmäßige, kompakte Sphäroide zu erzeugen und die AAV-Dosierung für jeden Zelltyp und Serotyp zu optimieren. Mit diesem Protokoll kann die Transgenexpression und -funktionalität mittels RT-qPCR, Western Blot, ELISA und somatischen Aktivitätsassays sowie durch kinetische Analyse des Einsetzzeitpunkts untersucht werden. Zukünftige Studien können Ko-Kulturen, Organoiden, Mikrofluidik, Immunzellen oder Gefäßstrukturen einbeziehen, um die in-vivo-Mikroumgebung besser nachzuahmen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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