Neuprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzelllinien aus eingefrorenen Buffy-Coat-Proben

Zweck dieses Protokolls ist es, menschliche gefrorene Buffy-Coats oder PBMCs in induzierte pluripotente Stammzellen umzuprogrammieren. Dieses Protokoll reinigt Buffy Coats nach dem Auftauen eindeutig und identifiziert eine somatische Zellmorphologie, die auf einen Erfolg der Umprogrammierung hinweist. Um zu beginnen, holen Sie den gefrorenen Buffy-Mantel, der aus menschlichem Blut gewonnen wurde, und legen Sie ihn auf Eis.

Rühren Sie die Probe vorsichtig in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius und nehmen Sie das Fläschchen heraus, wenn nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens vorsichtig tropfweise in ein konisches Rohr mit 12 Millilitern DPBS. Spülen Sie das Fläschchen mit einem Milliliter DPBS ab und geben Sie die Spülung in das konische Rohr mit den entnommenen Zellen.

Zentrifugieren Sie die Probe mit einem Drehschaufelrotor bei 200 g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in vier Millilitern DPBS mit 1 % FBS. Anschließend schichten Sie die Buffy-Coat-Mischung vorsichtig über drei Milliliter Dichtegradientenlösung, um das Mischen an der Grenzfläche zu vermeiden.

Zentrifuge mit einer Schwing-Bucket-Scheibe bei 800 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse. Mit einer Pipette wird die obere Plasmaschicht entfernt und entsorgt, ohne die Plasma-zu-Gradienten-Schnittstelle zu stören. Dann entferne die periphere mononukleäre Blutzelle, die PBMC-Schicht, an der Grenzfläche und übertrage sie in ein sauberes 15-Milliliter-Rohr.

Waschen Sie die PBMCs, indem Sie drei Milliliter Ausdehnungsmedium hinzufügen und bei 200 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Expansionsmedium, das Zytokine wie SCF, IL-3, EPO und IGF-1 enthält. Plattieren Sie die Zellen in einem Brunnen einer 12-Brunnen-Platte.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 20 % Sauerstoff für 10 bis 14 Tage. Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums, bis eine dichte Population heller, runder Erythroblasten beobachtet wird, was darauf hinweist, dass die Zellen transduktionsbereit sind. Drei Tage nach der Transduktion mit dem Sendai-Virus, das die Yamanaka-Faktoren trägt, wird die Zellen mit zwei Millilitern pro Bohrloch auf Maus-embryonalen Fibroblasten platiert.

Brüten Sie die Kulturen etwa sieben Tage lang aus und füttern die aufstrebenden Kolonien jeden zweiten Tag mit hESC-Medien. Legen Sie die Platte mit den transduzierten Zellen und den herauskommenden Kolonien unter ein Seziermikroskop. Verwenden Sie das Mikroskop, um eine Kolonie zu lokalisieren, um den Deckel der Platte aufzuheben, um den Brunnen freizulegen.

Öffne die Spritze aseptisch und lege die Nadel frei. Geleitet vom Mikroskop benutzt man die Nadelspitze, um die Kolonie von den umliegenden Futterzellen zu lösen, indem man die Umrisse der Kolonie nachzeichnet. Schneide die Kolonie mit der Nadelspitze in einige gleich große Stücke.

Wenn die Stücke sich nicht gelöst haben, benutze die Seite der Nadel, um sie vom Teller zu schöpfen oder abzukratzen, bis sie schwimmen. Nun mit einer P200-Pipette lokalisiert man die ausgewählte Kolonie unter dem Mikroskop, aspiriert die schwimmende Kolonie mit der Pipette und überträgt sie in einen Brunnen der vorbereiteten 24-Wellen-Platte. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Kolonie übertragen wird, ohne weitere Kolonien oder Futterzellen zu sammeln.

Stellen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 20 % Sauerstoff, bis die gewünschte Konfluenz erreicht ist. Identifizieren Sie Kolonien, die groß, rund sind und leuchtende Ränder zeigen, als bereit zum Spalten. Aspirieren Sie das Medium aus dem Brunnen und spülen Sie die Probe einmal mit einem Milliliter DPBS.

Dann entferne ich das DPBS und füge 500 Mikroliter 0,5 millimolare EDTA-Dissoziationspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für zwei Minuten, bis sich die Kolonien lockern und die Zellen sich aufrunden. Anschließend entferne die Platte aus dem Inkubator und aspiriere den EDTA-Dissoziationspuffer.

Mit einer P1000-Pipette werden die Zellen mit einem Milliliter menschlichen pluripotenten Stammzellmediums gesammelt, indem man sie sanft auf und ab pipettiert, bis die Kolonien abgetrennt und leicht zerbrochen sind. Übertragen Sie den einen Milliliter Medium und die Zellen in eine neue Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter frischen menschlichen pluripotenten Stammzellmediums. Platziere die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 20 % Sauerstoff.

Füttere induzierte pluripotente Stammzellen täglich, bis der Brunnen zusammenfließt und bereit ist, sich zu spalten. Währenddessen wird eine 10-cm-Schale mit 7 Millilitern von fünf Mikrogramm pro Milliliter Vitronektinlösung in DPBS beschichtet und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Um weiter zu teilen, geben Sie 7 bis 10 Milliliter menschliches pluripotentes Stammzellmedium zur 10-Zentimeter-Schüssel und übertragen die Zellen von der Sechs-Well-Platte in die Schale im Verhältnis 1:1 und inkubieren Sie wie zuvor gezeigt.

Überprüfen Sie, dass die Zellen in der 10-Zentimeter-Schale zusammenfließen, bevor Sie die Zellen erneut teilen. Passen Sie das Aufteilungsverhältnis anhand der Zellmorphologie und -dichte an, typischerweise mit einem Verhältnis von 1:10, und notieren Sie die Abschnittsnummer an jeder Passage. Schließlich charakterisiere induzierte pluripotente Stammzellen durch Bestätigung der NANOG-Expression des Stammmarkers mittels Immunfluoreszenz.

Differenzieren Sie die Zellen in Ektoderm-, Mesoderm- und Endodermlinien unter Verwendung definierter Kulturbedingungen. Beurteile das Differenzierungspotenzial durch Färbung von PAX6, Brachyury und SOX17 sowie Verlust der NANOG-Expression. Am Ende der Expansion differenzierten sich PBMCs zu Erythroblasten, die als helle, runde Zellen von großer und kleiner Größe erscheinen.

Kulturen ohne diese Zellen oder mit totem Erscheinen waren jedoch wahrscheinlich nicht erfolgreich umprogrammierbar. Erfolgreiche Transduktion und Umprogrammierung waren durch das Entstehen induzierter pluripotenter Stammzellkolonien auf bestrahlten Feederzellen gekennzeichnet, die dann eine typische Stammzellmorphologie entwickelten. Während Zellen, die keine stammzellähnliche Morphologie annahmen, nicht erfolgreich umprogrammiert wurden.

Erfolgreich umprogrammierte induzierte pluripotente Stammzellen zeigten dichte, runde Kolonien mit glatten, hellen Kanten. Subklone mit weniger idealer Morphologie, wie spontane Differenzierung oder dichte Zentren, wurden durch Anpassung der Spaltbedingungen beseitigt. Einige ausgewählte Kolonien konnten sich nicht erfolgreich ausbreiten.

Neben der Morphologie zeigten induzierte pluripotente Stammzellen Stammheit, wie die Expression des Stammmarkers NANOK zeigt. Reprogrammierte induzierte pluripotente Stammzellen zeigten ein Differenzierungspotenzial in Ektoderm, Mesoderm und Endoderm. Dieses Protokoll bietet detaillierte Kontrollpunkte, um den Erfolg der Neuprogrammierung zu verfolgen und vorherzusagen.

Um weiter zu bestätigen, dass eine iPSC-Linie geeignet ist, sollten Karyotypisierung, Genotypisierung und regelmäßige Mykoplasmatests durchgeführt werden. Dieses Protokoll ermöglicht eine Neuprogrammierung aus bestehenden Patientengruppen mit biobankierten Buffy Coats und erweitert so den Nutzen der iPSC-Technologie.