Verwendung von Lösungs-NMR zur Charakterisierung biomolekularer Kondensate unter biphasischen Bedingungen

Wir entwickelten NMR-Methoden zur Untersuchung biomolekularer Kondensate. Diese sind entscheidend für die zelluläre Organisation, aber ihre jegliche Information ist in mehreren Störungen impliziert. Mit unseren Methoden untersuchen wir die Eigenschaften des Kondensatmaterials, analysieren den Mechanismus ihrer Entstehung und überwachen langfristige Veränderungen wie die Kondensatreifung oder pathologische Fibrillation von Biomolekülen.

Zu Beginn bereiten Sie die abschließende biphasische Probe vor, die durch Agarose-Hydrogel stabilisiert wird, indem Sie die Proteinstocke, RNA-Aktien oder beides mit dem jeweiligen warmen Agarosepuffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Die endgültige Protein- oder RNA-Konzentration beträgt typischerweise 50 bis 500 Mikromolare für den NMR-Nachweis. Führe die vorbereitete biphasische Probe in ein Spektrometer ein, dann sperre, shim, matche und justiere den Protonenkanal wie gewohnt.

Kalibrieren Sie die 90-Grad-Pulslänge am Protonenkanal mit dem allgemeinen Kalibrierungsverfahren. Dann nehmen Sie ein eindimensionales, wasserunterdrücktes Spektrum auf und prüfen, ob das Spektrum starke biomolekulare Signale enthält. Wenn kein oder nur sehr wenig Signal beobachtet wird, verwenden Sie nicht REDIFINE, sondern verwenden Sie stattdessen das CONDENSE-MT.

Zeichnen Sie ein diffusionsgeordnetes Spektroskopie-Experiment auf, um die Diffusionsgradientenstärke von 2 bis 95 % in 16 linearen Schritten anzuordnen. Um weiterhin Daten für das vollständige REDIFINE-Set zu sammeln, erstellen Sie neun neue PPP GPQ GPQ S19-Experimente, indem Sie die Parameter des gerade durchgeführten ursprünglichen Experiments kopieren. In jedem aufeinanderfolgenden Experiment sollte nur die D20-Diffusionsverzögerung in variablen Schritten geändert werden, um den Bereich von 100 bis 1000 Millisekunden zu überspannen.

Führe jedes dieser Experimente mit dem entsprechenden Befehl aus. Verwenden Sie das letzte N, um die Empfängerverstärkung während der 10 Experimente zu erhalten. Setze Q-Zeichen mit SSB2 als Fensterfunktion.

Dann extrahieren Sie den fünften Schnitt mit dem entsprechenden Befehl. Phasen Sie das eindimensionale Spektrum und speichern Sie die Phasenparameter im zweidimensionalen Datensatz. Bearbeite den zweidimensionalen Datensatz mit dem XF2 und führe die Basiskorrektur mit ABS2 durch.

Danach extrahiere ich die 16 Scheiben mit geteiltem 2D. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die verbleibenden neun Experimente. Überprüfen Sie mindestens die ersten vier bis fünf Schnitte, um die korrekte Phasierung und Baseline-Korrektur sicherzustellen.

Korrigiere bei Bedarf die Phasierung und den Baseline manuell. Verwenden Sie dann den passenden MATLAB-Code für die Analyse. Im Code werden die Diffusionszeiten modifiziert, die PG-Werte entsprechend der Festigkeit des Probe-Gradienten festgelegt und die Experimente eins bis zehn basierend auf der Gesamtzahl der Experimente zugewiesen.

Dann passen Sie die Daten nach dem REDIFINE-Modell mit diesem Code an. Zeichnen Sie das 1D-Wasserunterdrückte Spektrum auf. Wenn nur sehr wenig Signal beobachtet wird, fahren Sie mit dem CONDENSE-MT-Experiment fort.

Bestimmung der R1-Wasserrate durch T1-Inversionsrückgewinnung für quantitative CONDENSE-MT. Kopiere die bereitgestellte Pulssequenz und die VD-Liste in die jeweiligen Ordner. Nach der Kalibrierung des Proton-90-Grad-Pulses stellen Sie NS auf 2, DS auf 0, D1 auf 20 Sekunden, SW auf 10 Teile pro Million ein.

TD2 auf 16K und TD1 auf 24. Für das CONDENSE-MT-Experiment kopieren Sie den bereitgestellten Bruker-Parametersatz, die Reihenfolge und die Häufigkeitsliste in die Bruker-spezifischen Ordner. Dann passen Sie die Frequenzen und die Leistung entsprechend dem Spektrometer an.

Stellen Sie P1 auf die kalibrierte 90-Grad-Pulslänge und P4 auf eine Mikrosekunde für den Anregungsimpuls ein, um Strahlungsdämpfung zu vermeiden. Stellen Sie NS auf 2, DS auf 16, D1 auf vier Sekunden, SW2 auf 20 Teile pro Million, TD2 auf 8k und TD1 auf die Länge der Frequenzliste. Setze SPNAM10 auf Squa100.000 und P10 auf fünf Sekunden.

Finde die SP10-Leistung, die 100-Hertz-Bestrahlungen liefert. Passen Sie die SP10-Leistung des Bestrahlungsimpulses entsprechend an. Führe das pseudo-zweidimensionale Experiment mit dem entsprechenden Befehl aus und richte eine Reihe dieser pseudo-2D-Experimente ein, wobei SP10-Bestrahlungsleistungen variieren.

Nachdem alle Parameter angepasst wurden, führe ich den Code aus, um das NMR-Spektrum auszulesen, das das Wassersignal integriert und in eine neue Variable speichert. In der Code-Inversionswiederherstellung passt man den Pfad auf die entsprechenden Daten an und prüft die Wasserintegrationsregion. Dann passen Sie die Experimentnummer an, die die Inversionswiederherstellungsdaten enthält.

Setze alle experimentellen Parameter und gib die zuvor durch das Anpassen des Agarose-Datensatzes erhaltenen Agarose-Empty-Pool-Werte ein. Führe den ersten Abschnitt des kondensierten leeren Codes aus, um die Passung für die längsgraduale Wasserrelaxation zu erhalten. Anschließend wird der Kondens-Leer-Fitting-Abschnitt durchgeführt, um die Live-Abbildung zu initiieren, die die Minimierung der Fitting-Funktion zeigt.

Führe den nächsten Abschnitt des Codes aus, um die Unsicherheiten zu bestimmen, und plotte die Daten. Die REDIFINE-Anpassung bestimmte die Diffusionskoeffizienten in der verdünnten und kondensierten Phase, die Proteinpopulation in der kondensierten Phase, die durchschnittliche Tröpfchengröße und die Interphasenpermeabilität für die FUS-N-Enddomänenprobe. Das NMR-Signal der FUS-N-Terminaldomäne blieb in der kondensierten Phase nachweisbar.

Es wurde kein Unterschied im Magnetisierungsübertragungsprofil zwischen der Agarose-Referenz und dem FUS-N-terminalen Bereich per Phas-Probe beobachtet. Bei CAG-Wiederholungs-RNA-Kondensaten wird kein NMR-Signal beobachtet. Dementsprechend unterscheidet sich das Magnetisierungsübertragungsprofil deutlich von der Agarose-Referenz.

Das CONDENSE-MT-Experiment lieferte eine dynamische Charakterisierung von RNA-Kondensaten der Wiederholungsexpansion. Die CONDENSE-MT-Analyse ergab die Protonenaustauschkinetik zwischen dem Kondensat und dem Massenwasser. Die CONDENSE-MT-Analyse ergab außerdem die transversale Relaxationszeit der RNA im Kondensat und die scheinbare transversale Relaxationsrate von Bulkwasser.

In diesem Protokoll können wir die Kondensateigenschaft im biphasischen Zustand charakterisieren, ohne dass ein chemisches Tag erforderlich ist. Die Tröpfchen koexistieren mit einer verdünnten Umgebung, was einen Austausch zwischen den beiden Phasen ermöglicht und die zelluläre Umgebung nachahmt. Unsere auf Kondensatcharakterisierung spezialisierten Methoden können durch konventionelle NMR-Methoden ergänzt werden, um molekulare Strukturwechselwirkungen und -dynamiken über Phasen hinweg zu untersuchen.

In zukünftigen Studien wollen wir komplexere Kondensatmodelle entwickeln, die Methodik an komplexere Systeme anpassen und schließlich Kondensat direkt in deren zellulären Umgebungen untersuchen.