Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Unsere Forschung konzentriert sich auf 3D-gedruckte Halterungen für parallele Säulenchromat-Verfahren zur DNA- und RNA-Isolierung, die eine Brücke zwischen manuellen und automatisierten Methoden schlagen. Dieses Verfahren behebt die Einschränkung zeitaufwändiger manueller Säulenchromat-Methoden, indem es die gleichzeitige Aufbereitung von bis zu 116 DNA- oder RNA-Proben ermöglicht. Beginnen Sie damit, mithilfe eines 3D-Druckers mit Schmelzschichtung und einer 0,4-Millimeter-Düse die Halterung zu drucken.

Verwenden Sie ein handelsübliches Polylactid (PLA), Polyethylenterephthalat-Glykol (PETG) oder Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) Filament mit 100 % Infill. Stellen Sie die Schichthöhe auf 0,1 Millimeter ein und aktivieren Sie die Oberflächenglättung. Passen Sie die Druckeinstellungen an, um Wasserdichtheit und mechanische Stabilität sicherzustellen.

Prüfen Sie die Racks vor der ersten Verwendung auf Wasserdichtigkeit. Füllen Sie das gedruckte Reservoir mit 70 % Ethanol, um es vor der Nutzung zu testen. Zentrifugieren Sie für schrittweise zunehmende Zeiträume, um das Fehlen von Leckagen oder strukturellen Schäden zu bestätigen.

Nach erfolgreicher Prüfung mit Klebstoff werden die Bestandteile des Basisreservoirs zusammengefügt, um eine dichte Einheit zu bilden. Inokulieren Sie Escherichia coli oder E. coli Transformanten in drei bis fünf Milliliter Lysogenie-Brühe (Lysogeny Broth, LB-Medium), die geeignete Antibiotika enthalten. Inkubieren Sie die Kultur 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Zentrifugieren Sie bei 2000 G für 10 Minuten, um die Zellen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie 250 Mikroliter Re-Suspensionspuffer zum Pellet hinzu.

Den Pellet vollständig durch Vortexen oder Pipettieren resuspendieren. 250 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen und vorsichtig durch vier bis sechsmaliges Umstülpen des Röhrchens oder durch Schaukeln der 24-Loch-Platte mischen.

Geben Sie 350 Mikroliter Neutralisierungspuffer hinzu und mischen Sie gründlich. Beobachten Sie die Bildung eines weißen Niederschlags, um eine erfolgreiche Neutralisation zu bestätigen. Geben Sie Lysepuffer in ein Gefäß, das Titandioxiddas Pulver enthält.

Fügen Sie ein Volumen-zu-Masse-Verhältnis von zwei zu eins hinzu. Geben Sie 250 µL der Titandioxidsuspension zum Lysat hinzu und mischen Sie durch Schütteln des Reaktionsgefäßes.

Fügen Sie 350 Mikroliter Neutralisierungspuffer hinzu und mischen Sie gründlich. Zentrifugieren Sie bei 2000 ×g für 10 Minuten. Beobachten Sie, dass das Zellpellet vollständig ausgefällt ist, in Gegenwart von Titandioxid, und dass der Überstand vollständig transparent erscheint.

Beachten Sie in Abwesenheit von Titandioxid das Vorhandensein von Restsediment im Überstand. Sammeln Sie den Überstand, ohne den Niederschlag zu stören, und überführen Sie ihn auf die Bindungssäule. Setzen Sie die DNA-Bindungssäulen in die Säulenhalterschicht des Racks ein.

Platzieren Sie die Säulendeckel in die dafür vorgesehenen Einsteckplätze, um sie während der Zentrifugation zu sichern. Setzen Sie die Klär- oder Filtersäulen direkt über den Bindungssäulen in die Filtersäulenschicht ein. Überführen Sie das vorbereitete neutralisierte Lysat in die Filtersäulen.

Platzieren Sie den zusammengesetzten Rack in einen Schwingkorbplattenrotor. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 2000 G und Raumtemperatur. Nachdem Sie den Rack aus der Zentrifuge entfernt haben, nehmen Sie die Filtercolumnschicht ab und entsorgen Sie diese.

Entsorgen Sie das Durchflussvolumen aus dem Reservoir in einen Abfallbehälter. Setzen Sie das Gestell mit den Bindungssäulen erneut zusammen. Geben Sie 500 bis 700 Mikroliter Waschpuffer in jede Bindungssäule.

Zentrifugieren Sie bei 2000 G für eine Minute. Entsorgen Sie den Durchlauf aus dem Reservoir und wiederholen Sie den Waschschritt, wie zuvor gezeigt. Entfernen Sie die Bindungssäulen aus dem Rack und überführen Sie sie in zwei Milliliter Sammelröhrchen.

Zentrifugieren Sie eine Minute bei 10.000 G oder höher, um die Membran zu trocknen. Überführen Sie die Säulen in saubere 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer oder Wasser direkt auf die Membran und inkubieren Sie die Säulen eine Minute bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie bei 10.000 G oder höher für eine Minute, um die DNA eluieren zu lassen. Die gesamte Plasmidausbeute zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen der konventionellen Methode und der Extraktion unter Verwendung der Rack-Konfigurationen. Die Plasmidbestätigung wurde mit ähnlichen Verteilungen der entspannten, linearisierten und supercoiled Formen beibehalten.

Die Farbstoffverteilung beschränkte sich auf den Abfallbereich direkt unterhalb der beladenen Säulen, wobei in benachbarten Vertiefungen oder auf benachbarten Säulentips kein sichtbares Signal nachgewiesen wurde, was darauf hindeutet, dass die Konstruktion des Racks die Wahrscheinlichkeit von Spritzern und einer Übertragung zwischen Säulen verringert. Die Amplifikation wurde nur in den Eluaten von Säulen detektiert, denen das Amplikon zugesetzt worden war. Dieses Partikel ermöglicht es Forschern, Plasmid-DNA in hoher Qualität für nachgeschaltete Anwendungen wie Klonierung, Sequenzierung und PCR-Analyse zu erhalten.

Die wichtigste Überlegung bei der Durchführung dieses Protokolls besteht darin, Kreuzkontaminationen zu vermeiden, indem ein dichter, nicht überlappender, 3D-gedruckter Reservoir verwendet wird. Außerdem können diese Gestelle nach diesem Verfahren für jede säulenbasierte Nukleinsäure-Extraktionsanalyse genutzt werden.