Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Wir untersuchen die Alterung der Adipozyten bei verschiedenen Fettdepots und Stoffwechselerkrankungen wie Fettleibigkeit und Hyperinsulinämie. Traditionelle SABG-Assays auf Basis von Brightfield erlauben Multiplexing kaum und sind sehr subjektiv. Unser neues Protokoll ist weniger subjektiv und erlaubt Multiplexing.

Um zu beginnen, holen Sie das Rohr mit dem menschlichen Fettgewebe heraus. Homogenisieren Sie 10 Gramm Fettgewebe und geben Sie es einem Rohr mit 0,05 % des kollagenen Enzyms des Typs 1 zu, um etwa eine Million stromale Gefäßfraktionen (SVF-Zellen) zu erhalten. Aliquot 500.000 Zellen in jedes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Gib einen Milliliter 2%-Paraformaldehyd zur Zellfixation in das Rohr. Dann 20 Minuten lang auf einer Schaukel bei Zimmertemperatur inkubieren. Zentrifugiere bei 600 G für 10 Minuten und entferne das Supernatant.

Bereiten Sie die X-Gal-Färbelösung mit dem Senescence Beta-Galactosidase-Färbungsset gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Gib einen Milliliter der Färbungslösung in drei frische Röhren. Und stellen Sie den pH-Wert auf fünf, sechs und acht an, indem Sie eine molare Salzsäure oder eine molare Natriumhydroxidlösung verwenden.

Verwenden Sie ein kalibriertes pH-Messgerät, um den pH-Wert zu überprüfen. Fügen Sie die pH-angepasste X-Gal-Färbelösung in jedes der beschrifteten Röhren mit 500.000 Zellen hinzu. Inkubiere bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden ohne Kohlendioxid.

Zentrifugiere die Zellen bei 600 G für 10 Minuten. Nachdem Sie das Supernatant entfernt haben, waschen Sie die Zellen mit PBS. Und wieder bei 600 G für 10 Minuten zentrifugieren.

Sobald der Supernatant entfernt wurde, inkubieren Sie die Zellen mit endothelzellspezifischem CD31 oder kontrollieren Sie IgG-Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,1 % PBST für 10 Minuten bei Zimmertemperatur auf einem Schaukelpult, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen. Und zentrifugiere bei 600G für 10 Minuten.

Nach dem Entsorgen des Supernatanten werden die Zellen eine Stunde lang mit einem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur auf einem Schaukelpult inkubiert. Zentrifugiere bei 600 G für 10 Minuten, um sekundäre Antikörperfärbungslösung zu entfernen. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBST und zentrifugieren Sie dann, wie zuvor gezeigt.

Zellen im Antifade-Mountant wieder suspendieren. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf Objektträger und härten Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur aus, um die Zellen zu immobilisieren. Am nächsten Tag gibst du 100 Mikroliter 100%iges Glycerol.

Legen Sie einen Deckel darauf und versiegeln Sie ihn mit Nagellack. Stellen Sie das vorbereitete Objektträger auf die Bühne eines konfokalen Mikroskops. In der Oberfläche der Mikroskop-Software wählen Sie die Option Lichtpfad und stellen Sie die Strahlsplittereinstellung auf T90R10 ein.

Als Nächstes überprüfen Sie die Cutoff-Wellenlängenwerte der sekundären dichroischen Spiegel, oder SDMs, in der Spiegeleinstellung. Im Detektormenü klicken Sie auf die Option Farbstoff und Detektorauswahl, um Kanäle und Anregungswellenlängen zuzuweisen. Setzen Sie dann die Prozentwerte der Laserleistungsintensität für jeden einzelnen Laser im Bereich von 10 bis 15 %. Im Serienmenü unter dem LSM-Abschnitt schalten Sie die Z-Option auf Ein. Stellen Sie die Z-Schrittlänge auf das Systemoptimum von 0,74 Mikrometern ein.

Anschließend geben Sie im Z-Abschnitt-Menü den Wert für das Start-Eingabefeld ein und definieren Sie einen Z-Stack basierend auf dem Membransignal, um das gesamte Zellvolumen zu erfassen. Geben Sie im Feld Acquire den Dateinamen und den Speicherort im LSM-Eingabefeld ein. Klicken Sie auf LSM Start, um die Bildaufnahme zu starten.

Und speichere die Dateien im native Mikroskopformat. Nach der Erfassung verwenden Sie die Z-Navigationspfeile, um das Signal und die Fokalverteilung verschiedener Farbstoffe über den gesamten Z-Stack zu überprüfen. Laden Sie die gespeicherte OIR-Datei im Bild J.In dem Popup-Fenster Bio-Formate Importoptionen hoch und klicken Sie auf Okay.

Klicken Sie auf Bildmenü, um die Datei zu öffnen. Und in den Dropdown-Menüs wählst du Farbe und dann die Option Kanäle aufteilen, um die verschiedenen Kanäle als separate Fenster zu öffnen. Anschließend passen Sie den Helligkeitskontrast an und optimieren Sie die LUT-Werte mit der Option Anpassen im Bildmenü zur verbesserten Visualisierung des Bildes.

Verwenden Sie die Z-Achsen-Scrollleiste am unteren Rand des Bildes, um die optischen Abschnitte zu durchqueren und zelluläre Merkmale im gesamten Stack zu überprüfen. Im Bildmenü wählen Sie Stack. Wählen Sie dann die Z-Projektfunktion, um summierte Intensitätsprojektionen des dreidimensionalen konfokalen Bildes zu erzeugen.

Im Z-Projektions-Dialogfeld definieren Sie die Start- und Stopp-Schnittbereiche. Wählen Sie den Projektionstyp aus und klicken Sie auf Okay, um das endgültige 2D-Composite-Bild zu erhalten. Als Nächstes navigiere zum Bildmenü.

Wählen Sie die Typ-Option, um den Bildtyp auf 16-Bit anzupassen. Speichere und exportiere dann die Bilder als 16-Bit-TIF-Dateien. Importieren Sie die gespeicherten Bilder in CellProfiler Version 4.2.8 für die automatisierte Zellsegmentierung, die Quantifizierung der reflektierten Lichtintensität für jede Zelle und das Exportieren der Intensitätsmesswerte in eine Tabelle.

In der Tabelle definieren Sie die Schwelle für seneszenzassoziierte Beta-Galactosidase-Positivität als Summe der durchschnittlichen reflektierten Lichtintensität der pH-8-Bedingung plus drei Standardabweichungen. Klassifizieren Sie die Zellen unter der pH-6-Bedingung als seneszenzassoziiert Beta-Galaktosidase-positiv, wenn ihre Intensitätswerte den festgelegten Schwellenwert überschreiten. Die reflektierte Licht-Senezenz assoziierte Beta-Galactosidase-Färbung menschlicher SVF-Zellen erzeugte klare und reproduzierbare Muster über drei pH-Werte.

Bei pH 5 zeigten die meisten Zellen aufgrund hoher endogener Enzymaktivität ein starkes Signal. Beim Assay-Standardwert pH 6 nahm die Signalintensität und -frequenz ab, was die spezifische Identifikation von seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase-Zellen ermöglichte. Bei pH 8 war das Signal minimal, was als Ausgangspunkt diente, um die Schwelle für Positivität zu definieren.

Nachweisempfindlichkeitstests zeigten, dass die reflektierte Lichtbildgebung Brightfield unter allen pH-Bedingungen übertraf. Bei pH 5 zeigte reflektiertes Licht starke X-Gal-Niederschläge, während Brightfield nur die größten Ablagerungen auffing. Bei pH 6 identifizierte reflektiertes Licht positive Zellen, die in Brightfield zu schwach oder diffus waren, um sie zu sehen.

Bei pH-Wert 8 erkannte die reflektierte Lichtbildgebung minimales Signal, was mit niedriger enzymatischer Aktivität übereinstimmt und Brightfield bei der Identifizierung von X-Gal-Niederschlägen bei mittleren und niedrigeren Aktivitätsniveaus übertraf. Insgesamt integriert dieser Workflow der reflektierten Lichtbildgebung die gleichzeitige Erkennung von pH-abhängigen, senezenzassoziierten, Beta-Galaktosidase- und fluoreszenzbasierten Markern wie CD31, wodurch Multi-Feature-Senezenzbewertungen mit Einzelzellauflösung in heterogenen SVF-Populationen ermöglicht werden. Dieses Protokoll ermöglicht sensible und quantitative SABG-Aktivitätsmessungen und berücksichtigt gleichzeitig sowohl andere Altersmarker als auch andere zelluläre Marker.

Die größte Herausforderung ist meiner Meinung nach die anfängliche Mikroskopie-Einrichtung. Aber sobald das optimiert ist, kann man dieselben Erfassungsparameter in allen Experimenten verwenden. Zukünftige Studien können diesen Test mit anderen subzellulären Markern kombinieren, um zu sehen, wie SABG mit verschiedenen zellulären Prozessen zusammenhängt.