Metabolische Markierung des entstehenden Transkriptoms in der frühen Embryogenese von Xenopus

In dieser Studie untersuchen wir, wie die zygotische Genaktivierung und die Übergangsregulation während der frühen Entstehung von Xenopus-Embryonen stattfinden. Bestehende Methoden haben Schwierigkeiten, die neu aktivierten zygotischen Transkripte zu detektieren, die reichlich mütterliche RNAs emittieren. Dieses Protokoll kennzeichnet und bereichert junge Transkripte.

Zu Beginn stellen Sie die Mikroinjektionskammer unter ein Stereomikroskop und geben Sie einen Milliliter Ficoll-Lösung in die Kammer. Erhalten Sie Xenopus laevis-Embryonen, die in 0,1-fach modifizierten Ringern oder MMR-Lösungen gelagert werden. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um 20 oder mehr Embryonen in die Mitte der Mikroinjektionskammer zu bringen.

Bereiten Sie die Injektionsnadel vor, indem Sie die feine Spitze einer Glasnadel mit einer Pinzette abschneiden. Positioniere die Nadel vertikal mit der Spitze nach unten und lade 0,5 Mikroliter 50 mM 5-Ethynyluridin oder 5 M EU mit einer P2-Pipette mit Mikroladespitze auf. Befestige die Nadel an einem Mikromanipulator.

Mit einer P10-Pipette werden 10 Mikroliter Halokarbonöl auf ein Stufenmikrometer unter einem Stereomikroskop platziert. Zur Volumenkalibrierung drücken Sie das Fußpedal des Mikroinjektors und spritzen Sie einen Tropfen in das Halokarbonöl auf dem Mikrometer. Stellen Sie den Druck und die Einspritzzeit am Mikroinjektor so ein, dass der Tropfendurchmesser 0,27 Millimeter beträgt.

Halten Sie den Einzellstufen-Embryo mit einer Pinzette und steuern Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator, um 10 Nanoliter 50 mM 5 EU zu injizieren. Bringen Sie die injizierten Embryonen in eine neue Glasschale mit Ficoll-Lösung und bebrüten Sie sie eine Stunde lang. Entferne die Ficoll-Lösung und gib 0,1 XMMR-Lösung hinzu. Untersuchen Sie die Embryonen während der Entwicklung visuell und entfernen Sie bei Bedarf alle abnormalen Embryonen.

Transferiere 10 Embryonen im gewünschten Entwicklungsstadium in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Entfernen Sie alle Restmedien aus dem Tub, frieren Sie die Embryonen in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend wird die gesamte RNA aus den Embryonen extrahiert und die Konzentration mit kommerziellen Bausätzen gemessen.

Um eine 50-Mikroliter-Klickreaktion zu erzeugen, mischen Sie die gezeigten Komponenten in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Inkubiere die Reaktionsmischung 30 Minuten lang auf einem Nutator bei Raumtemperatur. Gib nun Glykogen, Ammoniumacetat und gekühltes Ethanol zu jeder Reaktionsmischung.

Gut mischen, indem du fünfmal pipetterst. Über Nacht in einem Gefrierfach bei minus 80 Grad Celsius ausbrüten. Nach der nächtlichen Inkubation wird bei 13.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und anschließend das Überlagermittel entfernt, ohne das Pellet zu stören.

Waschen Sie das Pellet zweimal mit 700 Mikrolitern 75%-Ethanol. Nach der Zentrifugation und dem Entsorgen des Supernatanten wird das Pellet fünf bis zehn Minuten an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet und in 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser erneut suspendiert. Gib fünf Mikroliter streptavidinbeschichtete magnetische Perlen in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr.

Gib neun Mikroliter Waschpuffer 2 zu den Perlen und vermische gut. Stellen Sie das Rohr für zwei Minuten auf ein magnetisches Gestell. Entfernen Sie das Überdachungsmittel und wiederholen Sie die Wascharbeiten noch zweimal.

Dann die Perlen in fünf Mikrolitern Waschpuffer 2 wieder aufhängen. Bereite eine Mastermischung in einem 1,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenrohr vor. Fügen Sie jedem Röhrchen, das die RNA-Probe enthält, 15 Mikroliter der Mastermischung hinzu.

Stellen Sie das Rohr auf einen Heizblock und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 69 Grad Celsius. Danach legt man das Rohr auf Eis. Dann fügen Sie jeder RNA-Probe fünf Mikroliter vorgewaschene Perlen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf einem Nutator bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Perlen-RNA-Komplexe fünfmal mit 50 Mikrolitern Waschpuffer 1, gefolgt von fünf Waschen mit 50 Mikrolitern Waschpuffer 2. Die Perlen in fünf Mikrolitern Waschpuffer 2 wieder aufhängen. Verwenden Sie die Perlen, die die entstehenden EU-RNAs enthalten, direkt zur komplementären Desoxyribonukleinsäuresynthese und Bibliotheksvorbereitung.

Während der zygotischen Genomaktivierung wurden immer mehr unterschiedlich aktivierte Gene nachgewiesen, wenn das entstehende Transkriptom sechs Stunden nach der Befruchtung mit dem fünf Stunden nach der Befruchtung verglichen wurde, mit weiteren Zunahmen sieben Stunden nach der Befruchtung, acht Stunden nach der Befruchtung und neun Stunden nach der Befruchtung. Zygotische Gene wurden in höheren Konzentrationen und zu früheren Zeiten in den neu entstehenden EU-RNA-Sequenzierungsdaten im Vergleich zu den Gesamt-RNA-Sequenzierungsdaten nachgewiesen. Eine sorgfältige Reinigung metabolisch markierter entstehender RNAs ist der wichtigste Faktor, um Sensitivität und Spezifität in diesem Protokoll sicherzustellen.

EU-markierte naszente RNAs, die mit diesem Protokoll hergestellt werden, können biochemisch in vitro weiter analysiert werden. Dieser Ansatz ermöglicht zukünftige Studien, Genomaktivierungsmuster, gewebespezifische Genexpression und regulatorische Mechanismen als Einzelzellauflösung zu untersuchen.