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	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142, 620-632 (2015).</li><li>Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. 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A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro;m-Membranfilter</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M Zitronensäure&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>in dest. H2O vorbereiten</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>in dest. H2O vorbereiten</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>in dest. H2O vorbereiten</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>in dest. H2O vorbereiten</td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>in dest. H2O vorbereiten</td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-konjugierter sekundärer Antikörper 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovines Serumalbumin)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chemoluminiszenz-Substrat</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser für Zellkultur/Mikroskopie</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Basal Medium</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife M Melanocyte Kit&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphat-gepufferter Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Humane neonatale Melanozyten</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1 Antikörper (Kaninchen)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>Verdünnung 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Montiermedium mit DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamid-Gradientengele</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin, 0,1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>pRB Antikörper (Kaninchen)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>Verdünnung 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>selbst hergestellt</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM aktiviertes Na-Orthovanadat</td></tr><tr><td>RIPA-Puffer&nbsp;</td><td>selbst hergestellt</td><td>N/A</td><td>enthaltend: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>RLT-Puffer</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>enthalten im RNeasy Mini Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Magermilchpulver (für 5% Milch in TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat (für 0,1% Lösung)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsininhibitor, 0,5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butylhydroperoxid (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (für 0,3% Lösung)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>γH2AX Antikörper (Kaninchen)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>Verdünnung 1:200&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ein standardisiertes protokoll zur induzierung stressbedingter vorzeitiger seneszenz in primären menschlichen melanozyten mittels tert-butylhydroperoxid

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung des Seneszenzphänotyps von Melanozyten und dessen Beitrag zur extrinsischen Hautalterung. Bestehende Seneszenzmodelle verwenden Fibroblasten und erfassen nicht die biologischen Besonderheiten von Melanozyten. Dieses Protokoll induziert eine tBHP-vermittelte oxidativen Stress in primären humanen Melanozyten.Sammlen Sie zunächst die benötigten Reagenzien. Nach dem Auftauen der Melanozyten und einer Erholungsphase von drei Tagen stellen Sie sicher, dass die Zellen am Aussaatag eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Entfernen Sie das Medium aus dem Kolben ab. Waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzulösen. Stellen Sie den Kolben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Zellen, um eine vollständige Ablösung zu bestätigen. Geben Sie das 1,5-fache Volumen des Trypsin-Inhibitors zu, um die Reaktion zu stoppen.Überführen Sie die Zellsuspension in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie die Suspension mit DPBS auf ein Endvolumen von 10 Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension mit einer relativen Zentrifugalkraft von 100 × g für fünf Minuten.Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Medium auf das gewünschte Volumen. Säen Sie 600.000 Zellen pro 10-Zentimeter-Platte für mit tert-Butylhydroperoxid oder tBHP behandelte Platten aus. Säen Sie 400.000 Zellen pro Platte für die Kontrollplatten aus.Stellen Sie eine 10 Millimolar-Stammlösung aus dem tBHP-Vorrat unter Verwendung von DPBS oder Medium her. Geben Sie 100 Mikromolar tBHP pro Behandlung für eine Stunde zu den Zellen. Bewegen Sie die Platte vor und zurück, um das tBHP gleichmäßig im Medium zu verteilen.Die Zellen genau eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Inkubator stellen. Das Medium abziehen, um die tBHP-Behandlung zu beenden. Die Platten zweimal mit vorgewärmtem DPBS bei 37 Grad Celsius waschen.Fügen Sie das entsprechende Volumen frischen Mediums zu den Platten hinzu. Stellen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie die Zellen mindestens vier Stunden lang regenerieren, bevor die nächste Behandlung erfolgt. Wiederholen Sie den Behandlungsablauf später am selben Tag für die zweite Behandlung.Setzen Sie das Behandlungsschema bis zum vierten Tag fort und kultivieren Sie die Zellen anschließend bis zum neunten Tag, um Seneszenzmarker zu analysieren. Zählen Sie die mit tBHP behandelten Zellen und die Kontrollzellen. Säen Sie sie mit der gleichen anfänglichen Dichte erneut aus, oder säen Sie, falls weniger als 600.000 Zellen aus den mit tBHP behandelten Platten gewonnen wurden, alle gesammelten Zellen erneut aus.Zählen Sie die Zellen am vierten, neunten und 15. Tag der Kultur. Am neunten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 2 % Formaldehyd und 0,4 % Glutaraldehyd.Die fixierten Zellen zweimal mit PBS waschen. Die fixierten Zellen in einer Färbelösung bei pH 6 inkubieren. Die Platte abdecken, um sie vor Licht zu schützen, und anschließend 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid inkubieren.Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Bilden Sie unter Verwendung der Lichtmikroskopie die blaugefärbten Zellen ab und zählen Sie deren Anzahl. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Zellen im selben Feld.Geben Sie die Ergebnisse als Prozentsatz positiver Zellen an. Nach der Induktion von oxidativem Stress reduzierte die tBHP-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen die Proliferation der Melanozyten signifikant. Die behandelten Zellen erreichten am neunten Tag lediglich 1,4 kumulative Zellteilungen (cPDL), während die Kontrollen 3,1 cPDL erreichten.Am Tag 15 erreichten die behandelten Zellen ein Plateau bei 1,9 cPDL, während die Kontrollzellen auf 5,1 cPDL anwuchsen. Melanozyten, die mit tBHP behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu den Kontrollen zu allen gemessenen Zeitpunkten eine vergrößerte Zelloberfläche auf, wobei die Vergrößerung bis zum Tag 15 fortschritt, was mit der vergrößerten und abgeflachten Morphologie seneszenter Zellen übereinstimmt. Die mit tBHP behandelten Melanozyten zeigten eine Zunahme der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase, also der SA-Beta-Galactosidase-Aktivität, mit 32 % positiven Zellen im Vergleich zu 3 % in den Kontrollen.Der Anstieg der SA-beta-Galactosidase-Positivität war vereinbar mit einem seneszenten Phänotyp. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte erhöhte gamma-H2AX-Spiegel in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen. Die behandelten Zellen wiesen ein stärkeres gamma-H2AX-Signal als die Kontrollen auf.Die Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zeigte eine erhöhte Expression von Faktoren des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps, wobei Interleukin-8 den stärksten Anstieg aufwies. Interleukin-6 und Matrix-Metalloproteinase-1 zeigten moderat erhöhte Werte. Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Induktion der Seneszenz.Lamin B1 zeigte eine signifikante Verringerung in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen. Die Spiegel des phosphorylierten Retinoblastomproteins waren in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen reduziert. Die Behandlung mit tBHP erhöhte die transkriptionelle Expression von p16 und p21 in Melanozyten.Dieses Modell ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie seneszente Melanozyten die Pigmentierung beeinflussen und mittels SASP-entzündungsfördernder Faktoren mit umliegenden Zellen kommunizieren. Die Herausforderung bei diesem Protokoll liegt in der exakten Einhaltung der Zeitpunkte. tBHP muss zweimal täglich mit einem Abstand von mindestens vier Stunden angewendet werden.Mithilfe dieses Protokolls kann Seneszenz durch Nachweis seneszenter-assozierter Beta-Galaktosidase, Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Western Blotting etablierter Seneszenzmarker charakterisiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen.

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