Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung des Seneszenzphänotyps von Melanozyten und dessen Beitrag zur extrinsischen Hautalterung. Bestehende Seneszenzmodelle verwenden Fibroblasten und erfassen nicht die biologischen Besonderheiten von Melanozyten. Dieses Protokoll induziert eine tBHP-vermittelte oxidativen Stress in primären humanen Melanozyten.

Sammlen Sie zunächst die benötigten Reagenzien. Nach dem Auftauen der Melanozyten und einer Erholungsphase von drei Tagen stellen Sie sicher, dass die Zellen am Aussaatag eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen. Entfernen Sie das Medium aus dem Kolben ab.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen abzulösen. Stellen Sie den Kolben für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.

Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Zellen, um eine vollständige Ablösung zu bestätigen. Geben Sie das 1,5-fache Volumen des Trypsin-Inhibitors zu, um die Reaktion zu stoppen.

Überführen Sie die Zellsuspension in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen. Verdünnen Sie die Suspension mit DPBS auf ein Endvolumen von 10 Milliliter. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension mit einer relativen Zentrifugalkraft von 100 × g für fünf Minuten.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in Medium auf das gewünschte Volumen. Säen Sie 600.000 Zellen pro 10-Zentimeter-Platte für mit tert-Butylhydroperoxid oder tBHP behandelte Platten aus. Säen Sie 400.000 Zellen pro Platte für die Kontrollplatten aus.

Stellen Sie eine 10 Millimolar-Stammlösung aus dem tBHP-Vorrat unter Verwendung von DPBS oder Medium her. Geben Sie 100 Mikromolar tBHP pro Behandlung für eine Stunde zu den Zellen. Bewegen Sie die Platte vor und zurück, um das tBHP gleichmäßig im Medium zu verteilen.

Die Zellen genau eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in den Inkubator stellen. Das Medium abziehen, um die tBHP-Behandlung zu beenden. Die Platten zweimal mit vorgewärmtem DPBS bei 37 Grad Celsius waschen.

Fügen Sie das entsprechende Volumen frischen Mediums zu den Platten hinzu. Stellen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie die Zellen mindestens vier Stunden lang regenerieren, bevor die nächste Behandlung erfolgt. Wiederholen Sie den Behandlungsablauf später am selben Tag für die zweite Behandlung.

Setzen Sie das Behandlungsschema bis zum vierten Tag fort und kultivieren Sie die Zellen anschließend bis zum neunten Tag, um Seneszenzmarker zu analysieren. Zählen Sie die mit tBHP behandelten Zellen und die Kontrollzellen. Säen Sie sie mit der gleichen anfänglichen Dichte erneut aus, oder säen Sie, falls weniger als 600.000 Zellen aus den mit tBHP behandelten Platten gewonnen wurden, alle gesammelten Zellen erneut aus.

Zählen Sie die Zellen am vierten, neunten und 15. Tag der Kultur. Am neunten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 2 % Formaldehyd und 0,4 % Glutaraldehyd.

Die fixierten Zellen zweimal mit PBS waschen. Die fixierten Zellen in einer Färbelösung bei pH 6 inkubieren. Die Platte abdecken, um sie vor Licht zu schützen, und anschließend 18 Stunden bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid inkubieren.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Bilden Sie unter Verwendung der Lichtmikroskopie die blaugefärbten Zellen ab und zählen Sie deren Anzahl. Teilen Sie diese Zahl durch die Gesamtzahl der Zellen im selben Feld.

Geben Sie die Ergebnisse als Prozentsatz positiver Zellen an. Nach der Induktion von oxidativem Stress reduzierte die tBHP-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen die Proliferation der Melanozyten signifikant. Die behandelten Zellen erreichten am neunten Tag lediglich 1,4 kumulative Zellteilungen (cPDL), während die Kontrollen 3,1 cPDL erreichten.

Am Tag 15 erreichten die behandelten Zellen ein Plateau bei 1,9 cPDL, während die Kontrollzellen auf 5,1 cPDL anwuchsen. Melanozyten, die mit tBHP behandelt wurden, wiesen im Vergleich zu den Kontrollen zu allen gemessenen Zeitpunkten eine vergrößerte Zelloberfläche auf, wobei die Vergrößerung bis zum Tag 15 fortschritt, was mit der vergrößerten und abgeflachten Morphologie seneszenter Zellen übereinstimmt. Die mit tBHP behandelten Melanozyten zeigten eine Zunahme der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase, also der SA-Beta-Galactosidase-Aktivität, mit 32 % positiven Zellen im Vergleich zu 3 % in den Kontrollen.

Der Anstieg der SA-beta-Galactosidase-Positivität war vereinbar mit einem seneszenten Phänotyp. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte erhöhte gamma-H2AX-Spiegel in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen. Die behandelten Zellen wiesen ein stärkeres gamma-H2AX-Signal als die Kontrollen auf.

Die Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zeigte eine erhöhte Expression von Faktoren des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps, wobei Interleukin-8 den stärksten Anstieg aufwies. Interleukin-6 und Matrix-Metalloproteinase-1 zeigten moderat erhöhte Werte. Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Induktion der Seneszenz.

Lamin B1 zeigte eine signifikante Verringerung in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen. Die Spiegel des phosphorylierten Retinoblastomproteins waren in tBHP-behandelten Melanozyten im Vergleich zu Kontrollen reduziert. Die Behandlung mit tBHP erhöhte die transkriptionelle Expression von p16 und p21 in Melanozyten.

Dieses Modell ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie seneszente Melanozyten die Pigmentierung beeinflussen und mittels SASP-entzündungsfördernder Faktoren mit umliegenden Zellen kommunizieren. Die Herausforderung bei diesem Protokoll liegt in der exakten Einhaltung der Zeitpunkte. tBHP muss zweimal täglich mit einem Abstand von mindestens vier Stunden angewendet werden.

Mithilfe dieses Protokolls kann Seneszenz durch Nachweis seneszenter-assozierter Beta-Galaktosidase, Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Western Blotting etablierter Seneszenzmarker charakterisiert werden.