Kostengünstige Alternative zur Untersuchung der sozialen Präferenz bei Zebrafischen (Danio rerio) mit der 3-Kammer-Freischwimm-Aufgabe im offenen Becken

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige und quelloffene Freischwimm-Aufgabe mit drei Kammern in einem offenen Becken zur Untersuchung der sozialen Präferenz bei Zebrafischen. Dieses Protokoll kann mit verschiedenen Arten verwendet werden und ermöglicht es Studierenden, die soziale Präferenz mit minimalem Ressourcenaufwand zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst die Apparatur mit einem zentralen Versuchsbereich und zwei seitlich angrenzenden Stimuluskammern vor.

Installieren Sie das Hintergrundbeleuchtungssystem. Opake Trennwände und Polarisationsfilter dienen der Optimierung der visuellen Isolierung und des Video-Kontrasts. Befestigen und richten Sie die Kameras mithilfe des Kamerahalters vor den Kammern aus.

Ziehen Sie die Verdunkelungsvorhänge zu und halten Sie stabile Haltebedingungen aufrecht, bevor Sie das Experiment starten. Laden Sie die Open Broadcaster Software herunter und installieren Sie sie auf einem lokalen Computer mit Windows-Betriebssystem. Starten Sie nach dem Öffnen der Software den Assistenten zur automatischen Konfiguration, um die Einstellungen an die spezifischen Aufnahmeanforderungen, Hardware-Ressourcen und Netzwerkbedingungen anzupassen.

Überprüfen Sie die grundlegenden Einstellungen vor der Kamera-Konfiguration. Stellen Sie die Basis-Canvas-Auflösung so ein, dass sie mit der Anzeigeauflösung übereinstimmt, und wählen Sie die geeignete skalierte Ausgabauflösung. Erstellen Sie anschließend eine Szene, indem Sie im Szenenfeld mit der rechten Maustaste klicken und „Szene hinzufügen“ auswählen.

Weisen Sie der Szene einen Namen zu und verwenden Sie diesen, um das Stream-Layout festzulegen. Fügen Sie eine neue Quelle hinzu und wählen Sie „Video-Capture-Gerät“, um eine Webcam hinzuzufügen. Weisen Sie jeder Kamera einen eindeutigen Namen zu, beispielsweise „Kamera Mitte“, und wiederholen Sie diesen Vorgang für die zusätzliche Kamera.

Positionieren und skalieren Sie die Quellen im Vorschaufenster. Stellen Sie sicher, dass die Kamera in der Quellenliste aufgeführt ist. Bringen Sie die Kameraperspektive durch Drücken von Strg+D in die Mitte der Leinwand. Passen Sie die Ansicht an den Bildschirm an, indem Sie Strg+F drücken, oder dehnen Sie den Bildschirm durch Drücken von Strg+S. Beschneiden Sie die Quelle, indem Sie die Alt-Taste gedrückt halten und den Begrenzungsrahmen ziehen.

Klicken Sie anschließend doppelt auf die ausgewählte Kamera und anschließend auf „Configure Video“. Stellen Sie Helligkeit und Kontrast des Videos im Eigenschaftenmenü ein. Füllen Sie alle drei Kammern mit Wasser aus den Behälterbehältern und stellen Sie die Wassertemperatur ein, bevor Sie die Fische hinzufügen.

Stellen Sie sicher, dass die undurchsichtigen Trennwände zwischen den Kammern während der gesamten Eingewöhnungsphase eingesetzt sind. Überführen Sie einen erwachsenen Danio rerio in die zentrale Kammer und lassen Sie ihn sich mindestens eine Stunde lang eingleichen. Platzieren Sie den künstlichen sozialen Reiz in der seitlich linken Stimuluskammer.

Überführen Sie dann eine kleine Gruppe von vier Fischen, bestehend aus zwei Männchen und zwei Weibchen ähnlicher Größe, Alters und Vertrautheit, in die rechte Stimuluskammer. Während der Akklimatisierung versehen Sie alle Kammern, die lebende Tiere enthalten, mit einem Tauchheizer, der auf 26 Grad Celsius eingestellt ist, einem Luftsprudelstein, der an die Aquarienluftpumpe angeschlossen ist, sowie einem Beckendeckel, um stabile Haltungsbedingungen aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie die Heizer und Luftsprudelsteine, bevor Sie die experimentelle Sitzung beginnen.

Schalten Sie die Einzelkamera am mittleren Becken ein. Starten Sie die Software und vergrößern Sie die Ansicht der zentralen Kamera, indem Sie die Ecken des Videos per Drag-and-Drop ziehen, bis der Bildschirm ausgefüllt ist. Wählen Sie anschließend unter Steuerung die Option „Aufnahme starten“ aus.

Entfernen Sie sofort die undurchsichtigen Barrieren. Beenden Sie die Sitzung nach 10 Minuten, indem Sie unter Steuerungsoptionen Aufnahme beenden auswählen. Greifen Sie auf die aufgezeichneten Sitzungen zu, indem Sie im Menü oben links Datei auswählen und im Dropdownmenü Aufnahmen anzeigen wählen.

Laden Sie vier bis fünf Videos in eine Bewegungsanalysesoftware wie DeepLabCut und extrahieren Sie 20 bis 30 Einzelbilder aus jedem Video. Definieren Sie mindestens drei primäre Nachverfolgungspunkte, beispielsweise Kopf, Schwanz und Rumpf. Trainieren Sie das Netzwerk, diese Punkte über die Einzelbilder hinweg zu verfolgen.

Verwenden Sie ein auf ResNet-101 basierendes neuronales Netzwerk, um das Modell zu trainieren. Bestimmen Sie die Anzahl der Iterationen, die für den Abschluss des Trainings erforderlich sind. Stellen Sie anschließend das vollständig trainierte DeepLabCut-Modell auf den verbleibenden experimentellen Videos bereit und extrahieren Sie gemäß der Benutzeranleitung die Positionsdaten für jeden Versuch.

Verwenden Sie anschließend eine Programmiersoftware wie Python, um die Bewegung über die drei vertikalen, gleich breiten Versuchsbereiche zu definieren und zu analysieren, um die Präferenz zu quantifizieren. Messen Sie die Zeit in jeder Zone mithilfe von mindestens zwei Körperteilen innerhalb der identifizierten Zone, um die Auswirkungen von Tracking-Störungen zu verringern. Berechnen Sie die Gesamtzeit in jeder Zone, indem Sie die Gesamtanzahl der Bilder in der Zone durch die Gesamtanzahl der Bilder teilen.

Verwenden Sie dieselbe Codiersoftware, um die Zeit, die regungslos verbracht wird, beispielsweise das Einfrieren, zu definieren und zu messen. Legen Sie die Bewegungsschwelle bei 2 bis 5 Pixeln pro Einzelbild mit einer Mindestanzahl aufeinanderfolgender Einzelbilder von 15 fest. Erstellen Sie abschließend eine Zusammenstellung der Messwerte und exportieren Sie diese zur statistischen Analyse und Visualisierung.

Die Versuchstiere verbrachten signifikant mehr Sitzungszeit in der rechten Zone, die dem lebenden Schwarm am nächsten lag, im Vergleich zur mittleren Zone oder zur linken Zone, die dem künstlichen beweglichen Reiz am nächsten lag. Der Unterschied in der verbrachten Zeit zwischen der mittleren und der linken Zone war statistisch nicht signifikant. Die Versuchstiere verbrachten signifikant weniger Sitzungszeit bewegungslos in der mittleren Zone als in der rechten Zone, die dem lebenden Schwarm am nächsten lag, oder in der linken Zone, die dem beweglichen Reiz am nächsten lag.

Dieses Protokoll kann von Forschenden verwendet werden, um die Neigung eines Zebrafisches zu untersuchen, visuell mit zwei verschiedenen sozialen Reizen zu interagieren, und um festzustellen, welcher Reiz bevorzugt wird. Forschende können unterschiedliche Arten oder Reizkonfigurationen verwenden sowie andere Reaktionen untersuchen, wie beispielsweise plötzliches Davonschnellen oder ruckartiges Schwimmen. Das System bietet eine Plattform, um translationsrelevante Modelle der sozialen Funktionalität zu erforschen, und könnte pharmakologische sowie umweltbedingte Manipulationen untersuchen.