Ein Continuous Culture Millifluidic Device zur Untersuchung von Escherichia coli unter niedrigen und schwankenden Nährstoffbedingungen

Meine Forschung konzentriert sich darauf, zu untersuchen, wie sich Bakterien physiologisch an niedrige und schwankende Nährstoffbedingungen anpassen, die typisch für natürliche Umgebungen sind. Konventionelle Anbausysteme replizieren schlecht die niedrigdynamischen Nährstoffbedingungen, während unser System den Anbau unter diesen umweltrelevanten Bedingungen ermöglicht. Bereiten Sie die Übernachtkultur am Tag vor dem Experiment vor.

Bereiten Sie eine Vorkultur vor, indem Sie sechs Mikroliter der Übernachtkultur in ein Rohr mit sechs Millilitern voll reichhaltigem definiertem Medien, dem RDM, geben. Teilen Sie die Mischung gleichmäßig in zwei 15-Milliliter-Kulturröhren auf und beschriften Sie sie als A und B. Inkubieren Sie beide Röhren bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min. Überwachen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern mit Röhre B und fahren Sie erst fort, wenn die optische Dichte etwa 0,5 erreicht.

Während der Inkubation bereiten Sie das Low-RDM-Medium vor und verteilen Sie das Gesamtvolumen auf die Flaschen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Dann versiegeln Sie jede Flasche mit Deckeln, die mit drei Schläuchen versehen sind. Verbinden Sie das drittbreiteste Silikonrohr mit einem 0,2-Mikrometer-Lüftungsfilter für den sterilen Luftaustausch.

Befestigen Sie ein Ende jedes Peristaltikrohrs, das mit männlichen Luer-Lock-Steckern ausgestattet ist, an die kleineren Silikonröhren. Lassen Sie die Alufolieabdeckung am freien männlichen Luer-Schlossverschluss am anderen Ende der Peristaltikröhren, bis das Experiment beginnt, um eine Kontamination zu verhindern. Stellen Sie die Flaschen und die peristaltische Pumpe in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator.

Sichern Sie alle peristaltischen Schläuche in die Kanäle desselben Pumpenkopfs, um identische Durchflussraten über alle Filter hinweg zu gewährleisten. Verdünnen Sie die Vorkultur im Verhältnis eins zu zehn, indem Sie 600 Mikroliter Kultur in ein Rohr mit 5,4 Millilitern Low RDM geben. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette wird jeweils ein Milliliter verdünnte Kultur in jedes der sechs 0,45-Mikrometer-Polyvinylidenfluorid- oder PVDF-Filter gegeben.

Nach dem Ausspülen der Einwegventile mit autoklaviertem ultrareinem Wasser befestigen Sie sie an beiden Enden der Filter. Entfernen Sie die Alufolieabdeckungen von den Rohranschlüssen. Verbinden Sie jeden Filter mit den Anschlüssen des Peristaltikrohrs.

Stellen Sie den Durchfluss auf zwei Milliliter pro Minute an der Peristaltikpumpe ein. Platzieren Sie einen Abfallbehälter unter den Filtern, um den Abfluss aufzufangen, und starten Sie den Fluss. Nach zwei Stunden zieht man einen der an die Ein-Liter-Flasche angeschlossenen Filter ab, schraubt die Einwegrückschlagventile ab und setzt den Filter in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr, wobei der Einlass nach unten zeigt.

Zentrifugiere bei 2.000 G für zwei Minuten. Mit einem sterilisierten Rohrschneider üben Sie sanften Druck am Auslassende des Kunststoffgehäuses aus, um den Filter zu öffnen. Lösen Sie den inneren Zylinder und entsorgen Sie den membranhaltigen Abschnitt.

Spülen Sie die Innenwände des Filtergehäuses mit dem gesammelten Kulturmedium. Missen Sie das gesamte gesammelte Volumen mit einer Fünf-Milliliter-serologischen Pipette. Nehmen Sie drei 100-Mikroliter-Aliquoten aus der Probe und fixieren sie mit Glutaraldehyd auf eine Endkonzentration von 1,5 %. Ziehen Sie die entsprechenden Filter zu späteren Zeitpunkten ab und wiederholen Sie die Entnahme.

Beschriften Sie die gesammelten Proben entsprechend ihren jeweiligen Zeitpunkten. Kennzeichnen Sie die Proben mit dem fluoreszierenden DNA-Farbstoff und zählen Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Im Laufe der Zeit folgten die log 10 transformierten Zellzählungen linearen Trajektorien, was auf exponentielles Wachstum unter allen Bedingungen hinweist.

Die Wachstumsraten betrugen etwa 0,88 pro Stunde für die 0,5%RDM-Bedingung, 0,64 pro Stunde für die 0,25%-Bedingung und 0,18 pro Stunde für die 0,01%-Bedingung. Die Zellzählungen erreichten bis zu eine Milliarde Zellen pro Probe, was zeigt, dass das millifluidische kontinuierliche Kulturgerät, oder MCCD, sowohl exponentielles Wachstum als auch eine hohe Biomasseausbeute bei nanomolaren bis mikromolaren Nährstoffkonzentrationen unterstützt. Zellen, die in 0,5 % RDM gezüchtet wurden, hatten eine längere mittlere Zelllänge als Zellen in 0,01 % RDM.

Die größte Herausforderung bei der nährstoffarmen Kultivierung besteht darin, eine ausreichende Zelldichte aufrechtzuerhalten, um Verstopfungen, Druckaufbau und Nährstoffmangel zu verhindern. Nach diesem Verfahren können Zellen für andere nachgelagerte Analysen entnommen werden, darunter Proteomik, Metabolomik und andere Omics-Ansätze. Zukünftige Studien können die mikrobielle Anpassung an Nährstoffbegrenzung und -schwankungen untersuchen, indem dieses Protokoll mit einer quantitativen Omic-Analyse integriert wird.