Name: Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Lernen Sie die lysosomale Profilmethode mit LysoTracker Deep Red zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz in lebenden IMR-90 humanen Lungenfibroblasten. Dieses Live-Cell-Imaging-Protokoll liefert einen kontinuierlichen, quantitativen Seneszenz-Readout.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatte (flach, TC-behandelt)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Jede klare Mehrfachkulturplatte mit kompatiblem Live-Zell-Fluoreszenz-Imaging (z. B. 6-, 12- oder 24-Well TC-behandelte Polystyrolplatten; Glasboden-Imaging-Platten können für höhere Auflösung bevorzugt werden).</td></tr><tr><td>Beta-Galaktosidase-Färbeset (Seneszenz-Assay)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Jedes kommerzielle SA-β-Galaktosidase-Kit mit verifiziertem Färbepuffer bei pH 6,0. Zur Referenz enthält die Fixierlösung 2% Formaldehyd und 0,2% Glutaraldehyd in PBS und die Färbelösung enthält 1 mg/ml X-gal in DMF, 40 mM Citrat/Phosphat pH 6,0, 5 mM Kaliumferrocyanid, 5 mM Kaliumferricyanid, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (Software für wissenschaftliche Illustration)</td><td>BioRender</td><td>N/A – Web-Anwendung</td><td>Zum Erstellen von schematischen Abbildungen (Abbildungen 1-3) verwendet. https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Kohlendioxidgas (CO2), komprimierte Flasche</td><td>Airgas (oder ähnlicher Lieferant)</td><td>N/A</td><td>Medizinisches CO2, das zur Aufrechterhaltung einer 5%igen Atmosphäre im Zellkulturinkubator und in der On-Stage-Imaging-Kammer verwendet wird.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS), hitzeinaktiviert</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Jedes Zellkultur-FBS, das bei 56 °C hitzeinaktiviert ist; wird zu 10 % v/v in vollständigem Kulturmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit Live-Zell-Fähigkeit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Jedes Breitfeld- oder konfokales Fluoreszenzmikroskop mit Live-Zell-Temperatur- und CO2-Kontrolle, Filtersätzen für fernrot (Excitation ~647 nm / Emission ~670 nm) und DAPI/Hoechst (Excitation ~405 nm / Emission ~460 nm) Kanäle und einem 20x-40x Objektiv mit ausreichender NA zur Auflösung lysosomaler Merkmale. Das EVOS M7000 Imaging System wurde in dieser Studie verwendet.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Kernfärbung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Zellpermeabler DNA-Farbstoff für Live-Zell-Kernfärbung (blaue Fluoreszenz, Excitation ~405 nm). Nicht austauschbar mit DAPI, das unter physiologischen Bedingungen nicht zellpermeabel ist.</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Jede wissenschaftliche Berechnungsumgebung, die Kernsegmentierung, Kern-zu-Zellbereichserweiterung, Intensitätsschwellenwert und grundlegende Bildstatistiken unterstützt (z. B. Python mit scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). Die SenTrack-Pipeline (siehe Ergänzungsdatei S1) wurde für diese Studie entwickelt.</td></tr><tr><td>IMR-90 humane Lungenfibroblasten (Zellinie)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Normale humane fötale Lungen-Diploid-Fibroblasten-Zellinie, die zur Modellierung der zellulären Seneszenz verwendet wird; jede ähnlich charakterisierte humane Fibroblastenlinie kann substituiert werden.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Acidotropes Fluoreszenzfarbstoff für Live-Zell-Färbung von sauren Organellen; wird als 1 mM Vorrat in DMSO geliefert. Die Arbeitskonzentration beträgt 75 nM in vorbereitetem Zellkulturmedium.&nbsp; Fernrotemission (ex 647 nm / em 668 nm) minimiert die Überlappung mit der Lipofuszine-Autofluoreszenz, eliminiert sie aber nicht.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Basalkulturmedium für IMR-90-Fibroblasten; ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Jede Standardformulierung von Eagle's Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen und L-Glutamin kann substituiert werden.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Antibiotisches Supplement für vollständiges Kulturmedium; wird zu 1 % v/v verwendet (Endkonzentration 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin). Jede Standard Pen-Strep-Lösung kann substituiert werden.</td></tr><tr><td>Phenolrot-freies Imagingmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>Phenolrotfreies DMEM oder HBSS, das für Live-Zell-Imaging verwendet wird, um die Hintergrundfluoreszenz während der Aufnahme zu reduzieren. FluoroBrite DMEM ist eine häufig verwendete Option; jedes phenolrotfreie Imaging-Puffermedium, das mit 10% FBS ergänzt wurde, kann substituiert werden.</td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Isotonischer Puffer für Zellwäsche und Reagenzverdünnung; jedes sterile 1x PBS bei pH 7,4 kann substituiert werden.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (Software)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Open-Source-Einzeldatei-Python/Tkinter-Anwendung für lysosomale Seneszenz-Bildanalyse. Als Ergänzungsdatei S1 verteilt. Archiviert bei Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT-Lizenz. Quelle: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Stage-Top-Umgebungskammer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMC2000</td><td>Umgebungskammer für Live-Zell-Imaging am Mikroskop mit Temperatur (37 °C) und CO2 (5%) Kontrolle. Das EVOS Onstage Incubator wurde in dieser Studie verwendet; jede gleichwertige Stage-Top-Inkubator kann substituiert werden.</td></tr></tbody></table>

lysosomales profiling mit lysotracker zur quantitativen bewertung der zellulären seneszenz bei humanen fibroblasten

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

lysosomal-profiling-with-lysotracker-for-quantitative-assessment

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Lernen Sie die lysosomale Profilmethode mit LysoTracker Deep Red zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz in lebenden IMR-90 humanen Lungenfibroblasten. Dieses Live-Cell-Imaging-Protokoll liefert einen kontinuierlichen, quantitativen Seneszenz-Readout.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Weitere Videos entdecken